Аммиак, образующийся в почве, навозе и воде при разложении органических веществ, довольно быстро окисляется до азотистой, а затем азотной кислоты. Этот процесс получил название нитрификация.

До середины XIX в., точнее, до работ Л. Пастера явление образования нитратов объяснялось, как химическая реакция окисления аммиака атмосферным кислородом, причем предполагалось, что почва играет роль химического катализатора. Л. Пастер предположил, что образование нитратов - микробиологический процесс. Первые экспериментальные доказательства этого предположения были получены Т. Шлезингом и А. Мюнцем в 1879 г. Эти исследователи пропускали сточные воды через длинную колонку с песком и СаСО3. При фильтрации аммиак постепенно исчезал, и появлялись нитраты. Нагревание колонки или внесение антисептиков прекращало окисление аммиака.

Однако выделить культуры возбудителей нитрификации не удалось ни упомянутым исследователям, ни микробиологам, продолжавшим изучение нитрификации. Лишь в 1890-1892 гг. С. Н. Виноградский, применив особую методику, изолировал чистые культуры нитрификаторов. С. Н. Виноградский сделал допущение, что нитрифицирующие бактерии не растут на обычных питательных средах, содержащих органические вещества. Это было вполне правильным и объяснило неудачи его предшественников. Нитрификаторы оказались хемолитоавтотрофами, очень чувствительными к наличию в среде органических соединений. Эти микроорганизмы удалось выделить, используя минеральные питательные среды.

С. Н. Виноградский установил, что существуют две группы нитрификаторов - одна группа осуществляет окисление аммиака до азотистой кислоты (NH4+→NO2-) - первая фаза нитрификации, другая окисляет азотистую кислоту до азотной (NO2-→NO3-) - вторая фаза нитрификации.

Бактерии обеих групп в настоящее время относят к семейству Nitrobacteriaceae. Это одноклеточные грамотрицательные бактерии. Среди нитрифицирующих бактерий имеются виды с весьма различающейся морфологией - палочковидные, эллипсоидные, сферические, извитые и дольчатые, плеоморфные. Размеры клеток разных видов Nitrobacteriaceae колеблются от 0,3 до 1 мкм в ширину и от 1 до 6,5 мкм в длину. Имеются подвижные и неподвижные формы с полярным, субполярным и перитрихиальным жгутикованием. Размножаются в основном делением, за исключением Nitrobacter, который размножается почкованием. Почти у всех нитрификаторов имеется хорошо развитая система внутри - цитоплазматических мембран, значительно различающихся по форме и расположению в клетках разных видов. Эти мембраны подобны мембранам фотосинтезирующих пурпурных бактерий.

Бактерии первой фазы нитрификации представлены пятью родами: Nitrosomonas, Nitrosococcus, Nitrosospira, Nitrosolobus и Nitrosovibrio. Единственный микроорганизм, детально изученный к настоящему времени, - Nitrosomonas europaea.

Nitrosomonas представляет собой короткие овальные палочки размером 0,8 - 1X1-2 мкм. В жидкой культуре Nitrosomonas проходят ряд стадий развития. Две основные из них представлены подвижной формой и неподвижными зооглеями. Подвижная форма обладает субполярным жгутиком или пучком жгутиков. Помимо Nitrosomonas, описаны представители и других родов бактерий, вызывающие первую фазу нитрификации.

Вторую фазу нитрификации осуществляют представители родов Nitrobacter, Nitrospira и Nitrococcus. Наибольшее число исследований проведено с Nitrobacter winogradskii, однако описаны и другие виды (Nitrobacter agilis и др.).

Nitrobacter имеют удлиненную клиновидную или грушевидную форму, более узкий конец часто загнут в виде клювика. Согласно исследованиям Г. А. Заварзина, размножение Nitrobacter происходит путем почкования, причем дочерняя клетка бывает обычно подвижна, так как имеет один латерально расположенный жгутик. Известно чередование в цикле развития подвижной и неподвижной стадий. Описаны и другие бактерии, вызывающие вторую фазу нитрификации.

Нитрифицирующие бактерии обычно культивируют на простых минеральных средах, содержащих аммиак или нитриты (окисляемые субстраты) и углекислоту (основной источник углерода). В качестве источников азота эти организмы используют аммиак, гидроксиламин и нитриты.

Нитрифицирующие бактерии развиваются при pH 6-8,6, оптимум pH составляет 7,5-8. При pH ниже 6 и выше 9,2 эти бактерии не развиваются. Оптимальная температура развития нитрификаторов - 25-30°С. Изучение отношения различных штаммов Nitrosomonas europaea к температуре показало, что некоторые из них имеют оптимум развития при 26°С или около 40°С, а другие могут довольно быстро расти при 4°С.

Нитрификаторы - облигатные аэробы. С помощью кислорода они окисляют аммиак до азотистой кислоты (первая фаза нитрификации):

NH4++11/22О2→NO2-+H2O+2H+

А затем азотистую кислоту до азотной (вторая фаза нитрификации):

NO2-+1/2O2→NO3-

Предполагают, что процесс нитрификации проходит в несколько этапов. Первым продуктом окисления аммиака является гидроксилами, который затем превращается в нитроксил (NOH), либо пероксонитрит (ONOOH), который, в свою очередь, преобразуется в дальнейшем в нитрит или нитрит и нитрат.

Нитроксил, как и гидроксиламин, по-видимому, может димеризоваться в гипонитрит или превращаться в закись азота N2O - побочный продукт процесса нитрификации.

Кроме первой реакции (образования гидроксиламина из аммония), все последующие превращения сопровождаются синтезом макроэргических связей в виде АТФ, необходимых клеткам микроорганизмов для связывания СO2 и других биосинтетических процессов.

Фиксация СO2 нитрификаторами осуществляется через восстановительный пентозофосфатный цикл, или цикл Кальвина. В результате фиксации углекислоты образуются не только углеводы, но и другие важные для бактерий соединения - белки, нуклеиновые кислоты, жиры и т. д.

По существовавшим до последнего времени представлениям, нитрифицирующих бактерий относили к облигатным хемолитоавтотрофам.

Сейчас получены данные, свидетельствующие о способности нитрифицирующих бактерий использовать некоторые органические вещества. Так, отмечено стимулирующее действие на рост Nitrobacter в присутствии нитрита дрожжевого автолизата, пиридоксина, глютаминовой кислоты и серина. Поэтому предполагают, что нитрифицирующие бактерии обладают способностью переключаться с автотрофного на гетеротрофное питание. Нитрифицирующие бактерии все же не растут на обычных питательных средах, так как большое количество легкоусвояемых органических веществ, содержащихся в таких средах, задерживает их развитие.

Отрицательное отношение этих бактерий к органическому веществу в лабораторных условиях, казалось бы, противоречит естественным условиям их обитания. Известно, что нитрифицирующие бактерии хорошо развиваются, например, в черноземах, навозе, компостах, то есть в местах, где содержится много органического вещества.

Однако указанное противоречие легко устраняется, если сравнить количество легкоокисляемого углерода в почве с теми концентрациями органического вещества, которое нитрификаторы выдерживают в культурах, Так, органическое вещество почв представлено главным образом гуминовыми веществами, на которые приходится, например, в черноземе 71-91% общего углерода, а усвояемые водорастворимые органические вещества составляют не более 0,1% общего углерода. Следовательно, нитрификаторы не встречают в почве больших количеств легкоусвояемого органического вещества.

Этапность процесса нитрификации - характерный пример так называемого метабиоза, то есть такого рода трофических связей микробов, когда один микроорганизм развивается после другого на отходах его жизнедеятельности. Как было показано, аммиак - продукт жизнедеятельности аммонифицирующих бактерий используется Nitrosomonas, а нитриты, образующиеся последними, служат источником жизни для Nitrobacter.

Возникает вопрос о значении нитрификации для земледелия. Накопление нитратов происходит с неодинаковой интенсивностью на разных почвах. Однако этот процесс находится в прямой зависимости от плодородия почвы. Чем богаче почва, тем большее количество азотной кислоты она может накапливать. Существует метод определения доступного растениям азота в почве по показаниям ее нитрификационной способности. Следовательно, интенсивность нитрификации можно использовать для характеристики агрономических свойств почвы.

Вместе с тем при нитрификации происходит лишь перевод одного питательного для растений вещества - аммиака в другую форму - азотную кислоту. Нитраты, однако, обладают некоторыми нежелательными свойствами. В то время как ион аммония поглощается почвой, соли азотной кислоты легко вымываются из нее. Кроме того, нитраты могут восстанавливаться в результате денитрификации до N2, что также обедняет азотный запас почвы. Все это существенно снижает коэффициент использования нитратов растениями. В растительном организме соли азотной кислоты при их использовании для синтеза должны быть восстановлены, на что тратится энергия. Аммоний же используется непосредственно. В связи с этим ставится вопрос о подходах к искусственному снижению интенсивности процесса нитрификации путем использования специфических ингибиторов, подавляющих активность бактерий - нитрификаторов и безвредных для других организмов.

Следует отметить, что некоторые гетеротрофные микроорганизмы способны осуществлять нитрификацию. К гетеротрофным нитрификаторам относятся бактерии из родов Pseudomonas, Arthrobacter, Corynebacterium, Nocardia и некоторые грибы из родов Fusarium, Aspergillus, Penicillium, Cladosporium. Установлено, что Arthrobacter sp. окисляет в присутствии органических субстратов аммиак с образованием гидроксиламина, а затем нитрита и нитрата.

Некоторые бактерии способны вызывать нитрификацию таких азотсодержащих органических веществ, как амиды, амины, гидроксамовые кислоты, нитросоединения (алифатические и ароматические), оксимы и др.

Гетеротрофная нитрификация встречается в естественных условиях (почвах, водоемах и других субстратах). Она может приобретать главенствующее значение, особенно в атипичных условиях (например, при высоком содержании органических С - и N - соединений в щелочной почве и т. п.). Гетеротрофные микроорганизмы способствуют не только окислению азота в этих атипичных условиях, но и могут вызывать образование и накопление токсических веществ; веществ, обладающих канцерогенным и мутагенным действием, а также соединений с химиотерапевтическим действием. В связи с тем, что некоторые из этих соединений вредны для человека и животных даже при относительно низких концентрациях, следует тщательно изучить их образование в естественных условиях.

Эти бактерии отнесены к группе аэробных хемолитотрофных бактерий и родственных им организмов (группа 12 по “Определителю бактерий Берджи”). Все нитрифицирующие бактерииразделены на две секции – А (бактерии, окисляющие нитрит) и В (бактерии, окисляющие аммиак). Это грамотрицательные бактерии, очень разнообразные по форме (палочковидные, кокковидные, извитые), могут быть подвижны за счет налачия жгутиков или неподвижны.

Нитрификация – это процесс превращения аммония в нитрат, протекающий в две стадии. Нитрифицирующие бактерии используют ион аммония (нитрозобактерии) или нитрит (нитробактерии) в качестве донора электронов для протекания окислительно-восстановительных реакций, в том числе и процесса дыхания (табл.1).

Таблица 1

Микроорганизмы, участвующие в процессах нитрификации

нитрификации	Протекающие процессы	Примеры микроорганизмов, участвующих в процессе
	2NH 4 + + 3O 2 → 2NO 2 - + 4H + +2H 2 O	Нитрозобактерии: Nitrosomonas europaea, Nitrosococcus oceanus , Nitrosolobus multiformis
	2NO 2 - + O 2 → 2NO 3 -	Нитробактерии: Nitrobacter winogradskyi , Nitrospina gracilis , Nitrococcus mobilis , Nitrospira marina

Каждая из стадий требует участия строго определенных нитрифицирующих бактерий. Ни один из нитрификаторов не способен осуществлять обе стадии процесса.

Нитрифицирующие бактерии широко распространены в почвах, морской и пресной воде; играют важную роль в процессах переработки сточных вод.

3.5. Архебактерии

Архебактерии (группы 31-35 по “Определителю бактерий Берджи”) – самые древние бактерии, часто живущие в экстремальных условиях (в горячих серных источниках, соленых озерах, засоленных или щелочных почвах и т.п.). Некоторые архебактерии являются симбионтами в пищеварительном тракте животных.

Эти микроорганизмы имеют своеобразное строение генетического материала, клеточной стенки, цитоплазматической мембраны и выделены в отдельную категорию Mendosicutes . Они отличаются от эубактерий:

 по составу клеточной стенки (не содержит пептидогликана; вместо него в состав клеточной стенки входит псевдомуреин или только белки или полисахариды);

 по составу ДНК-зависимой РНК-полимеразы;

 по нуклеотидным последовательностям рибосомальных РНК;

 по составу молекул т-РНК (содержат псевдоуридин);

 имеют специфический состав мембранных липидов;

 некоторые гены архебактерий содержат интроны, что для остальных бактерий не характерно.

Архебактерии подразделяются на следующие группы:

Метаногенные архебактерии – в результате жизнедеятельности образуют метан, в качестве донора электронов используют Н 2 . Метанобразующие бактерии разнообразны по форме; среди них встречаются кокки (Methanococcus sp. ), палочки (Methanobacterium sp. ), спириллы и другие формы. Представители этой группы – строгие анаэробы, грамвариабельны. Среди них встречаются мезофилы и термофилы. Например, для представителей рода Methanothermus оптимальная температура роста - 83-88 о C.

Сульфатредуцирующие архебактерии (например, представители рода Archaeoglobus ) – грамотрицательные бактерии, кокковидные, могут быть неправильной формы. Строгие анаэробы. В процессе метаболизма восстанавливают SO 4 2- до H 2 S.

Экстремально галофильные бактерии (галобактерии) – растут при высоких концентрациях солей. Представлены кокками или палочками неправильной формы; грамвариабельные. Аэробы. Растут при концентрации NaCl не менее 1,5 М (оптимальная – 2-4 М). Встречаются в природе в соленых озерах, засоленных почвах (Halobacterium sp. , Halococcus sp. ). Среди этой группы бактерий встречаются алкалофилы, растущие при рН > 8,5 (Natronobacterium sp. , Natronococcus sp. ; обитают в щелочных озерах и почвах).

Архебактерии, лишенные клеточной стенки (представители рода Thermoplasma ) – полиморфные грамотрицательные бактерии, факультативные анаэробы. Являются облигатными термофилами (оптимальная температура роста 45-67 о С) и ацидофилами (растут при рН 0,5-4,5).

Экстремальные термофилы и гипертермофилы, метаболизирующие серу имеют клетки различной формы. Среди них встречаются как аэробы, так и анаэробы. В анаэробных условиях восстанавливают S до H 2 S, в аэробных - окисляют H 2 S или S до SO 4 2- . Оптимальная температура роста для этих бактерий – 70-105 0 С. Обитают в серных горячих источниках, зонах вокруг подводных вулканов. Наиболее известны представители родов Sulfolobus (аэробы), Thermofilum, Desulfurococcus , Pyrococcus (строгие анаэробы). Особо следует отметить бактерий рода Pyrodictium , которые способны расти в диапазоне температур 80-110 о С, причем оптимальной для них является температура 105 о С.

Фильтрация и цихлидный аквариум. Часть 1.
Евгений Грановский

Этот материал, замысленный еще в стародавние времена, до создания этого сайта, оказался для меня настоящей ловушкой. Активная позиция на интернет-форумах требовала каждый раз писать слишком много слов, хотелось скомпоновать и систематизировать информацию, чтобы потом просто ссылаться. На деле же это означало новый уровень погружения в тусклый мир патрубков и губок вместо того, чтобы писать о диковинных тропических рыбах и далеких биотопах. И, в итоге, я вовсе перестал что-либо писать. Материал наверное бы так и остался у меня в компьютере, если бы Сергей Аникштейн не сподвиг меня довести работу до какого-то более или менее читаемого состояния и, собравшись с духом, так опубликовать. Текст, несмотря то, что в него добавлен ряд новых параграфов, изрядно сырой. Кое-какие моменты мне и самому по прошествии лет кажутся спорными или, как минимум, требующими дополнительной проверки. Впрочем, аквариумистика – это не та область, где может и должно быть единственно правильное мнение, и подчас противоположные решения приводят в нашем деле к одинаково хорошему результату. В любом случае, думаю, что представленный материал окажется хорошим отправным пунктом для аквариумиста, который хочет разобраться в этих вопросах. Но самое главное здесь – это не впасть в излишний технофетишизм, ибо на свете существует еще очень много всего, гораздо более интересного и занимательного, чем химические реакции, фильтры и помпы.

* * *

В современной аквариумистике фильтры являются одним из важнейших средств жизнеобеспечения. Аквариум - замкнутое биологическое пространство, в котором происходит постоянное накопление органических остатков: рыбы производят выделения, которые загрязняют воду; плюс несъеденный корм, помертвевшие части растений и т.д. В природных водоемах концентрация отходов в воде достаточно стабильна, поскольку часть их перерабатывается в минеральные вещества и ассимилируется растениями, а другая часть выносится вместе с водными потоками. В аквариуме плотность посадки рыб существенно превышает природную, поэтому продукты обмена и их неорганические производные могут оказывать негативное воздействие на его обитателей.

Основными способами удаления из аквариума излишков минеральных и органических остатков и налаживания в нем приемлемых условий жизни рыб является фильтрация, чистка, подмены воды и применение сорбирующей химии.

Наряду с навыками обращения с фильтрующими системами, помпами, сифонами и абсорбентами аквариумист должен обладать также определенным объемом теоретических знаний. Неотъемлемой частью современной аквариумной науки является так называемый "азотный цикл". Если вы откроете старые книжки, то не найдете там ни слова ни о биофильтрах, ни об азотном цикле. Первого тогда просто не существовало, второе же протекало само собою, о чем аквариумисты "старой школы" лишь смутно догадывались говоря об неком "биологическом равновесии", которое наступает само собой через несколько недель после запуска. То, как правило, были густо заросшие аквариумы с нейтральной или подкисленной водой, населенные "харацинкой" или "живородкой", где живые растения достаточно энергично поглощали ядовитые аммонийные соединения, а если те и присутствовали в незначительных остаточных дозах, то преимущественно в виде относительно безопасных ионов аммония NH 4 +. Более того, в "голландские аквариумы", с большим количеством растений и малым числом рыб, нитраты вносились искусственно!

Увлечение цихлидами, захватившее аквариумистику начиная с 1970-х годов, потребовало от аквариумистов намного более углубленных знаний в области биофильтрации. Хотя до того этот сегмент был уже в значительной мере освоен морскими аквариумистами. Именно они первыми столкнулись с проблемой ядовитых нитрогенов и стали разрабатывать соответствующие системы водоочистки. Вслед за "моряками" и цихлидоводами на эту проблему обратили и другие аквариумисты, а производство аквариумных фильтров превратилось в целую отрасль аквариумной индустрии.

В настоящем материале обобщены и систематизированы личный практический опыт и информация, почерпнутая в различных источниках. Их список приведен в конце. Хочу поблагодарить всех, чьи публикации и высказывания на аквафорумах помогли мне в составлении этого материала.

Азотный цикл, нитрификация

Не съеденный корм и выделенные с экскрементами не потребленные рыбой белки - это основные поставщики органических соединений в воде, в которой начинается цикл биологических превращений, осуществляемых различными микроорганизмами. На первом этапе этого цикла сложные азотсодержащие органические соединения утилизируются до простых неорганических - так называемая минерализация. Азот - один из основных элементов, необходимых для животных и растений. Он входит в животные и растительные белки. В результате разложения экскрементов рыб, остатков корма и растений, погибших организмов образуется аммиак NH 3 (ammonia). Аммиак обладает способностью взаимодействовать с ионами водорода H + , находящимися в воде, или с молекулами воды, образуя ионы аммония NH 4 + (ammonium):

NH 3 + H + = NH 4 +

2NH 3 + 3O 2 = 2NO 2 - + 2H + + 2H 2 O,

либо 2NH 4 + + 3O 2 = 2NO 2 - + 4H + + 2H 2 O,

а затем в нитрат-ионы (с буквой "а") NO 3 - .

2NO 2 - + O 2 = 2NO 3 - .

Процессы окисления аммиака и ионов аммония до нитрит-ионов, а затем до нитрат-ионов называются нитрификацией. Эти процессы протекают в аэробной (т.е. богатой кислородом) среде под действием бактерий-нитрификаторов, существующих в аквариуме. Практический смысл нитрификации заключается в переводе соединений азота из очень токсичных форм (аммиак, нитрит) в малотоксичную (нитрат). Нитраты - тоже вредны, однако не настолько, как предыдущие соединения азота. Но на этом цикл азота не прекращается. Существует и обратный - восстановительный процесс, называемый денитрификацией, который мы, в большинстве своем, на настоящий момент не используем. Потому в аквариумной практике азотный цикл чаще всего рассматривается в только в аспекте нитрификации. В этом аспекте современная аквариумистика фактически построена на принципе "пролонгированной протоки", т.е. нитрат выводится из аквариума посредством замены загрязненной воды на свежую. Также существенную роль играют живые растения, поглощающие нитраты. В цихлидом аквариуме, где растительности мало или она вовсе отсутствует, биологическое равновесие биосистемы и здоровье рыб во многом зависит от технического оснащения и регулярности обслуживания. Хорошая аэрация и фильтрация является обязательным условием нормального функционирования такой системы, а поддержание концентрации нитратов на безопасном уровне осуществляется посредством интенсивных вливаний свежей воды. Несмотря на существование ряда альтернативных решений (включая биологические методы денитрификации, о которых будет рассказано в третьей части статьи), ведра и шланги являются неотъемлемым аквариумным инвентарем.

Токсичность азотных соединений

Сам по себе газообразный азот, молекулы которого состоят из двух атомов N 2 , химически и биологически инертен и практически безвреден. А вот азотные соединения, накапливающиеся в аквариуме, способны нанести вред его обитателям. Схематически изменение концентраций соединений азота в аквариуме в процессе нитрификации и изображено на графике.

Изменение концентраций соединений азота в аквариуме

Согласно "Перечню рыбохозяйственных нормативов предельно допустимых концентраций (ПДК) и ориентировочно безопасного уровня воздействия (ОБУВ) вредных веществ для воды водных объектов, имеющих рыбохозяйственное значение" (М.: Изд. ВНИРО, 1999), ПДК азотных соединений для рыб:
аммиак - 0,05 мг/л;
аммоний - 0,5 мг/л;
нитрит - 0,08 мг/л (значение нитритно-азотной концентрации);
нитрат - 40 мг/л.

Хотя практика показывает, что аквариумные рыбы кратковременно способны переносить значительно более высокие дозы нитрогенов, эти значения не следует превышать.

Аммиак является сильно токсичным соединением. Он легко попадает в кровь и внутренние органы рыбы, накапливается там и потом выводится очень долго, вплоть до недель, т.е. рыба единожды отравившаяся аммиаком может через какое-то время погибнуть, причем без всяких внешних признаков. Отравления аммиаком также делает рыб подверженными стрессу и ослабляет их сопротивляемость болезням. Летальный уровень неионизированного аммиака составляет примерно 0,2–0,5 мг/л для различных видов рыб. Ионы аммония тоже токсичны, но в меньшей степени. Токсичность аммиака уменьшается в соленой воде. Соотношение концентраций NH 3 и NH 4 + в воде также зависит от ее кислотности и температуры: в кислой и холодной воде аммиак практически отсутствует, в щелочной и теплой среде его концентрация возрастает. Поэтому в аквариумной литературе советуют подкислять воду для предотвращения отравления рыб. Понижение pH действительно приводит к снижению токсичности аммиака, однако при этом активность нитрифицирующих бактерий, перерабатывающих аммиак падает. А при pH ниже 5, их жизнедеятельность практически прекращается.

Проблема усугубляется тем, что имеющиеся в нашем распоряжение тесты показывают общую концентрацию аммонийных соединений, не отделяя аммиак от аммония. Их процентное соотношение можно определить, используя специальные таблицы, исходя из показателей pH и температуры воды. Но лучше всего устроить фильтрацию так, чтобы тест показывал нулевое значение.

Существующее однако мнение, что при значениях рН=7 и менее риск вероятность аммиачного отравления является практически нулевым. В подтверждение чего указывается, что в "доцихлидную" эпоху, когда аквариумисты содержали преимущественно тропических "кисловодных" рыб, случаи отравлений аммиаком были очень редки, и эта проблема возникла только с наступлением "моды" на африканских цихлид, требующих щелочной воды. На мой взгляд, это неверная аргументация, т.к она не принимает во внимание тот существенный момент, что в прежние времена все аквариумы, в т.ч. выростные, в обязательном порядке содержали растения, которые и выполняли роль естественного биофильтра и аэратора, причем довольно успешно. Тем более, как выше указано, ионы аммония тоже не безвредны и при накапливании могут вызвать длительное отравление.

Отдельной проблемой является наличие аммонийных соединений (далее по тексту мы будем называть их обобщенно "аммиак") в водопроводной воде - в период осенних дождей и весеннего паводка концентрация может достигать 0,5–1 мг/л. Более детально это рассмотрено в статье " ". Причем здесь аммиак опасен даже не столько своей абсолютной концентрацией, сколько резким скачком его содержания в аквариуме при обильной подмене воды.

Нитрит также ядовит. Длительное пребывание рыб в воде с нитритно-азотной концентрацией более 0,1 мг/л (или общей нитритно-ионовой концентрацией более 0,33 мг/л) нежелательно, летальными могут оказаться дозы от 1 мг/л.

Примечание: существуют две измерительные шкалы содержания нитрита: общей нитритно-ионовой концентрации (NO 2 -), т.е. содержание азота и кислорода; и нитритно-азотной концентрации (NO 2 – N), т.е. содержание только азота в нитрит-ионе. Коэффициент соотношения этих показателей равен 3,3, то есть, зная одно значение, можно вычислить другое. В книгах обычно указывается показатель нитритно-азотной концентрации, а вот в аквариумных тестах - как правило общей нитритно-ионовой.

Хочу еще раз подчеркнуть - в нормально функционирующем аквариуме содержание аммиака и нитрита должно быть нулевым.

Нитраты - значительно менее токсичны, чем аммиак и нитриты. Безопасной для большинства видов рыб считается концентрация ионов NO 3 - до 50 мг/л. Хотя известны случаи аквариумов с содержанием нитрата до 400 мг/л (!!!), что ни в коем случае не должно рассматриваться как рекомендация к действию. В тоже время, существуют виды цихлид, например, у дикарей Uaru fernandezyepezi самочувствие ухудшается уже при концентрации 10-20 мг/л. Однако даже если мы не видим очевидных признаков отравления или ухудшения самочувствия, рыба внешне здорова и нерестится, в долговременном аспекте нитраты являются одной из главных причин гексамитоза и др. заболеваний у проблемных видов и возрастных рыб и оказывают воздействие даже более вредное, чем неправильное кормление, хотя негативный их эффект проявляется не сразу. Даже в относительно небольших и формально "безопасных" концентрациях нитраты незаметно, но верно укорачивают срок жизни нашим питомцам. Также есть основания предположить наличие токсичного "кумулятивного эффекта" при сочетании с нитратов с нитритным или аммонийным фоном (при недостаточной биофильтрации). Поэтому и для сравнительно неприхотливых видов, лучше установить такой режим подмен воды, чтобы концентрация NO 3 - была минимальной. Следует также избегать резких изменений концентрации нитратов не только в большую сторону, но и в меньшую, в частности, при пересадке рыб в другую емкость или при больших подменах воды.

Симптомы отравления рыб азотными соединениями достаточно хорошо описаны в литературе. В частности, об этом можно прочесть в статье "Состав аквариумной воды: основные проблемы" , размещенной на веб-сайте vitawater.ru. Оттуда же можно узнать, как с помощью специальных препаратов, как фирменных, так и "народных" (соль, марганцовка, метиленовая синь) улучшить самочувствие рыбок. Однако если изначально сделать все по уму: оснастить аквариум хорошим фильтрационным оборудованием и обеспечить должный режим обслуживания, т.е. устранить причину "заболевания", не будет нужды бороться с его симптомами.

Виды фильтрации

Основное назначение аквариумных фильтров - очистка воды, удаление из нее нежелательных составляющих (органических и минеральных частиц, молекул, ионов, микроорганизмов). Фильтрацию можно разделить на три основных вида:

Механическая;
- биологическая;
- химическая.

Механическая фильтрация - улавливание взвешенных в воде частиц. При механической фильтрации поток воды проходит через какой-либо мелкопористый материал, на котором задерживаются сравнительно крупные частички грязи и аквариумного мусора. В качестве фильтрующего субстрата обычно применяются синтетические губки и мочалки, специальный поролон, синтепон и т.д.

Теоретически, эффективность очистки возрастает при уменьшении размера частиц фильтрующего материала или диаметра проходных каналов. Однако это уменьшение возможно лишь до определенных пределов, поскольку при этом начинает возрастать сопротивление потоку жидкости и снижается производительность фильтра. Считается, что лучше применять фильтрующие элементы с различной величиной проходных каналов. Вода, последовательно минуя слои со все уменьшающимися каналами, будет равномерно очищаться во всем объеме фильтра. Во внешних и в некоторых видах внутренних фильтров используется многослойный фильтрующий элемент (керамические кольца - крупнопористые и мелкопористые губки - синтепон). При работе механического фильтра в нем происходит накопление отфильтрованного материала, поэтому необходимо регулярно проводить промывку фильтрующего элемента.

К механической фильтрации можно и отнести и регулярную чистку дна сифоном (сифонка грунта) при подменах воды.

Биологическая фильтрация - многостадийный, многоступенчатый процесс, осуществляемый аммонифицирующими и нитрифицирующими, по разложению органики и преобразованию сильнотоксичных аммиака, аммония и нитрита в малотоксичный нитрат (а при полном цикле - в газообразные азот). Этот процесс может протекать естественным образом непосредственно в аквариуме, но для получения хорошего результата требует специального устройства - биофильтра.

Биологическая и механическая фильтрация тесно между собой связаны. Во-первых, потому, что один и тот же фильтр может выполнять роль и механического, и биологического. Во-вторых, тем, что задача очистки аквариума от органических нечистот решается одновременно как в биологически, посредством нитрификации, так и механически, т.е непосредственно удалением грязи из аквариума. И таким образом сильная механическая фильтрация ослабляет нагрузку, ложащуюся на биофильтр, и наоборот.

Химическая фильтрация , под которой в аквариумной практике понимают прежде всего сорбцию , является специфичным видом. С помощью химических фильтров из аквариумной (или вновь заливаемой) воды удаляются вредные органические и неорганические вещества, а также могут изменяться параметры воды и вноситься в нее полезные вещества. В зависимости от характера сорбции различают адсорбенты - тела, поглощающие вещество на своей (обычно сильно развитой) поверхности, и химические поглотители, которые связывают поглощаемое вещество, вступая с ним в химическое взаимодействие. Отдельную группу составляют ионообменные сорбенты, поглощающие из растворов ионы одного типа с выделением в раствор эквивалентного количества ионов другого типа. Химическая фильтрация наиболее распространена и популярна с помощью активированного угля в качестве адсорбента. Применяется и ряд других химических наполнителей. Это минералы из группы цеолитов, синтетические ионообменные смолы, а также торф. Цеолиты и ионообменные смолы поглощают аммиак, нитраты, фосфаты и др. и вместо них выделяют безвредные ионы натрия, хлора, сульфата и т.д. Торф слегка подкисляет воду и вносит в нее различные биологически активные вещества. К химической фильтрации можно отнести и пеноотделительные колонки, которые удаляют органические молекулы из воды прежде, чем они будут разложены с выделением аммиака. Озонаторы тоже в какой-то степени выполняют химическую фильтрацию путем окисления органики.

Кроме фильтрации, в аквариумной практике применяется также стерилизация воды как метод ее очистки. Способами стерилизации являются озонирование и ультрафиолетовое облучение.

Нитрифицирующие бактерии

Процесс нитрификации - это процесс окисления, основную роль в котором, естественно, играет кислород. Однако этот процесс происходил бы намного медленнее, не будь в аквариуме множества микроорганизмов, принимающих в нем участие. Эти микроорганизмы известны также под собирательным названием "активный ил ".

Предварительную работу делают минерализаторы, превращающие органику в аммиак. Такой способностью обладают многие микроскопические водные обитатели. Поэтому, в принципе, набор видов может быть свой для каждого конкретного аквариума. В частности, это бактерии Achromobacter, Micrococcus, Flavobacterium, Paracoccus и др. Их колонии образуются стадийно. Одни виды вытесняют другие. Помутнение воды в недавно запущенном аквариуме (т.н. "бактериальная муть") является как раз проявлением взрывообразного размножения одних микроорганизмов, чаще - инфузорий, с постепенной заменой их другими и/или падением размера популяции.

Каждая из стадий азотного цикла осуществляется своими бактериями. Аммиак-окисляющие бактерии Nitrosococcus и Nitrosomonas осуществляют процесс NH 3 (NH 4 +) => NO 2 - , а нитрит-окисляющие Nitraspira и Nitrobacter - процесс NO 2 - => NO 3 - .

Процесс заселения аквариума полезными бактериями происходит постепенно. Для успешной работы им требуется определенные условия: пища (аммиак и нитриты), кислород, приемлемая гидрохимия, температура и субстрат, где они будут селиться. Согласно исследованиям оптимальные условия для развития бактерий Nitraspira spp.: концентрация нитритов 0,35 mM, pH 7,6–8,0, температура 39°C. Последнее, естественно, это не означает необходимости разогревать аквариум до столь экстремальной температуры, для большинства аквариумных рыб она является смертельной. Нитрификаторы будут замечательно работать и при 22–28°С. Следует также помнить, что при повышенных значениях температуры и pH возрастает процентное содержание неионизированного аммиака.

Основным местом жительства (субстратом) для аммонифицирующих и нитрифицирующих бактерий являются фильтры, особенно внешние, с внушительным объемом и большой площадью поверхности различных наполнителей. Конечно, эти бактерии живут и в толще воды, но там их значительно меньше. В принципе, в качестве субстрата подходит любая поверхность, но она должна иметь достаточно большую площадь. Голых стенок аквариума для создания работоспособной популяции недостаточно. В аквариумах, лишенных биологического фильтра, в роли субстрата, выступает грунт, однако в нем ощущается дефицит другого жизненно важного компонента нитрификации - кислорода. Поэтому проточный биофильтр является оптимальным для заселения нитрификаторами. См. также статью " ".

Хотя нитрифицирующие бактерии присутствуют повсюду, даже в хлорированной водопроводной воде и в воздухе (отдельные клетки или микроколонии), в свежезапущенном аквариуме их катастрофически мало. Размножаются бактерии быстро - удвоение популяции происходит за 12–32 часа. Однако, согласно исследованиям аквариумов и биофильтров, для налаживания нитрификации требуется от 12 до 22 дней.

Вначале в аквариуме нет нитритов, только аммиак и аммоний, и нарождаются одни аммиак-окисляющие бактерии. По мере появления нитритов в действие включаются нитрит-окисляющие бактерии. Причем есть основания считать, что колония нитрит-окисляющих бактерий прихотливее, рост ее более медленный, и ей может быть причинен больший урон, чем первой колонии при том же воздействии. Например, известно, что Nitraspira могут подавляться даже избытками аммиака. А если учесть, что пищу для их поставляет первая колония, то неудивительно почему задержка в переработке нитритов в новом аквариуме может быть долгой. А потом наоборот исчерпывается аммиак, и аммиак-окисляющие бактерии начинают голодать и сокращать популяцию, зато теперь много пищи для нитрит-окисляющих бактерий... Таким образом, получаются два взаимосвязанных, но разбалансированных цикла со своими пиками и спадами, и задача биофильтрации состоит в том, чтобы эти циклы синхронизировать и развить, и добившись баланса обеих групп бактерий, гибко реагировать на любые изменения аквариумной биохимии.

"Опрокидывание" биофильтра

При неблагоприятных условиях, например, отсутствие питания или достаточного количества кислорода, бактерии переходят в т.н. инактивное состояние ("спячка"), когда минимальный энергетический обмен поддерживается для обеспечения основных функций клетки. При возобновлении подходящих условий бактерия "просыпается". Но если инактивный период длится слишком долго, наступает смерть и распад бактериальной клетки.

Особенно критичны для колоний нитрифицирующих бактерий в биофильтре длительные отключения электричества и сильное загрязнение субстрата с образованием в нем застойных анаэробных зон. Причем опасно не столько само прекращение процесса нитрификации, сколько то, что на их месте поселяются другие, гетеротрофные бактерии, и в анаэробной (безкислородной) среде начинается противоположный процесс - . И при этом велика вероятность, что он пойдет по "неправильным" сценариям - с образованием таких таких ядовитых соединений, как сероводород (H 2 S) и метан (CH 4), или остановится на стадии восстановления нитрата в нитрит. И хорошо, если обойдется просто временным помутнением воды, но может обернуться и массовым замором рыбы. Падение производительности (напора воды) фильтра, как правило, свидетельствует о загрязнении субстрата. Если напор упал ниже 30–40% от максимального, фильтр следует промыть и перезапустить заново, иначе это может привести к его биологическому "опрокидыванию". Не следует также отключать фильтр на продолжительное время. Сильно загрязненный фильтр может представлять опасность для обитателей аквариума уже через 2–3 часа простоя; менее загрязненные могут сравнительно легко пережить без притока свежей воды нескольких часов или даже суток. Кроме степени загрязненности фильтра это зависит от многих факторов, в т.ч. объема аквариума (в больших аквариумах биохимия гораздо более стабильна) и плотности посадки рыб. Но лучше лишний раз этим не рисковать.

"Бактериальная муть"

Под этим термином обычно понимается помутнение или побеление воды, нередко сопровождающееся затхлым запахом. Данное явление характерно для аквариумов с неразвитой или нарушенной биофильтрацией, либо случается от переизбытка органики (при перекорме или при перенаселении). Также может быть вызвано большим вливанием свежей воды или использованием "аквахимии". Еще один "верный" способ получить сильное помутнение воды - налить в аквариум некоторую дозу спирта или водки (но об этом чуть позже). "Бактериальная" или, как ее еще называют "инфузорная" муть является проявлением бурного размножения в аквариумной воде одноклеточных организмов, в большинстве своем гетеротрофных, и их конкуренции между собой. Эти процессы Самвел Купалян метко назвал "междоусобными войнами" микроорганизмов. Сама по себе "бактериальная муть" не опасна для рыб, хотя косвенно является признаком неблагоприятной обстановки в аквариуме и внешне представляет собой малоэстетичное зрелище. Но прямой зависимости между мутностью воды и содержанием вредных веществ в аквариуме нет. Растворенные в воде токсичные соединения азота, возникающие в результате отсутствия или нарушения биофильтрации, незаметны для глаза. Возможна ситуация, когда вода помутнела, а тесты на аммиак и нитрит показывают нулевую или очень низкую концентрацию этих веществ. Но может быть и наоборот: вода в аквариуме кристально прозрачная, а нитриты зашкаливают.

В заново запускаемом аквариуме вода может сильно помутнеть на второй-третий день (хрестоматийный, но вовсе не обязательный случай). Если система правильно оборудована и обслуживается, то через несколько дней "бактериальная муть" исчезает сама собой. Когда помутнение возникает в зрелом аквариуме, оно проходит после устранения причины его возникновения. И первое, что я рекомендую сделать, если обнаружилось, что вода "ни с того ни с сего" помутнела - это усилить аэрацию. В качестве радикального способа устранения бактериальной мути нередко советуют УФ-стерелизатор. При прохождении через ультрафиолетовое излучение создающие муть микроорганизмы гибнут, и вода становится прозрачной. Однако следует понимать, что таким образом не устраняется первопричина возникновения мути.

Немного истории

Если вы откроете старые книжки, то прочтете там много интересного и правильного о таких химических показателях воды как PH, электропроводимость и жесткость, а также хитроумных способах их измерения, однако не найдете ни слова ни о биофильтрах, ни об азотном цикле. Первого тогда просто не существовало, второе же характеризовалось неким абстрактным понятием "биологическое равновесие", которое наступает само собой через несколько недель после запуска аквариума. Видовой состав рыб - в основном, "живородка" и "харацинка" - и наличие в аквариумах большого числа живых растений в значительной мере компенсировали эти пробелы в теоретических знаниях и технической оснащенности. Думаю, что серьезное отставание нашей страны в области цихлидоводства было в известной мере обусловлено именно этими "особенностями национальной аквариумистики". Ведь содержание цихлид предъявляет к фильтрации повышенные требования. В более поздних публикациях наших авторитетных аквариумистов необходимость аквариумных фильтров признается. " Современная аквариумистика отвечает на этот вопрос положительно",- декларирует Игорь Иванович Ванюшин в опубликованной в 1999 г. в журнале "Миллион Друзей" статье "Нужна ли в аквариуме фильтрация?" Тогда же в литературе появилось множество руководств по изготовлению самодельных внутренних фильтров из пластиковой бутылки и т.п. "Невозможно себе представить, сколько существует конструкций фильтров,- пишет Игорь Иванович,- более того, почти каждый аквариумист вносит свой вклад, изменяя виденное или создавая что-то оригинальное, свое, в ту пору когда всерьез заинтересуется фильтрацией воды".

Одновременно пришло понимание необходимости регулярных подмен воды с целью устранения из нее нитратов и других вредных веществ. То было удивительное время прозрения, когда аквариумистам открылись причины необъяснимых смертей и заболеваний их питомцев. Первые отечественные биофильтры появились еще в 1980-х годах, причем подчас обладали весьма замысловатыми конструкциями. Недостатками самодельных внешних фильтров, которые в значительной мере сводили на нет их достоинства, были громоздкость и ненадежность. Поэтому отношение к внешним фильтрам, даже несмотря на появление в продаже эргономичных и надежных импортных канистровых фильтров, по-прежнему было настороженным. Мнение И.И. Ванюшина (статья "Покупаем Аквариумы" в журнале "Миллион Друзей" №1.2000) на этот счет достаточно показательно: " Не вникая в детали, все фильтры можно разделить на наружные и внутренние. Какой лучше - судите сами, если свою главную задачу по очистке от мусора и вредных примесей они выполняют примерно одинаково... Наружный фильтр почти не ограничивает собой внутреннего пространства аквариума. Внутри проходят только две трубки - для откачивающей и нагнетающей магистралей, все остальное - снаружи. Этим, пожалуй, и ограничиваются его достоинства" . Серьезным противопоказанием против брендовых канистр была их высокая стоимость, а китайские сильно уступали им по качеству. Поэтому многие аквариумисты-любители отдавали предпочтение широко распространившимся у нас в стране в конце 1990-х годов стаканным внутренним фильтрам, сочетающим в себе стильный дизайн и доступную цену, при этом явно преувеличивая их возможности в отношении биофильтрации, а в профессиональной аквариумистике получили распространение встроенные биофильтры. Еще одной альтернативой и своеобразным этапом становления биофильтрационной техники в России был так называемый эрлифт, состоящий из большой губки, подъемной трубы и аэратора. Этот вид фильтра и сейчас успешно используется в выростных аквариумах.

Рассказ Евгения Цигельницкого: "Никогда не забуду свой первый фильтр - разбирающуюся пополам, щелястую коробочку в полстакана из розово-белого "под мрамор" пластика (из такого делали самые дешевые мыльницы) на сизой, скверно пахнущей присоске, жиденько заполненную какими-то нитками, через неделю ставшими совершенно похожими на сопли. К нему сверху через поганенький резиновый переходник крепился простейший эрлифт из пары стеклянных трубок - потолще и потоньше. А набитые в фильтр нитки "сообразительные мы" (с отцом) заменили на мочалку для посуды. Помню и тот фильтр, и мое детское изумление от того, сколько эта маленькая, убогая штуковина за неделю собирала всякой грязи в моем скромном, чистеньком на взгляд трехведерном аквариуме (полностью нагружая собой целый трескучий компрессор). Продвинутые люди тогда пользовали эрлифты из братской ГДР, мне тоже такой привез после долгого нытья дед аж из Ленинграда. И я стал продвинутым – с нереальной, убойной ГДРовской губкой в трехведернике и переехавшей в ведерный ("школьный") малечник мраморной "мыльницей". Целых два фильтра было - во как! Кстати, эта губка у меня трудилась–служила–кочевала по аквариумам почти пятнадцать лет. До сих пор жалею, что она куда-то делась… То есть - воду в аквариумах люди фильтровали еще при советской власти, но большинство фильтрующих – не делало из этого культа, и никоим образом не заботилось происходящими при этом биохимическими событиями… Грязь собрал - и ладно…"

Денитрификация и денитрифицирующие бактерии

Процесс восстановления нитратов до газообразных оксидов и молекулярного азота называется денитрификацией. Это вторая часть азотного цикла. В пресноводной аквариумистике этот процесс используется крайне редко, но тем не менее несомненно заслуживает рассмотрения. В отличие от нитрификации, где важнейшую роль играет растворенный в воде кислород, процессы денитрификации происходят в среде, лишенной кислорода, или, говоря научным языком, анаэробной. Денитрификация определена как превращение нитрата в азот - безвредный газ, который уходит пузырьками наружу. Между начальным продуктом (нитратом) и конечным продуктом (газообразным азотом) существуют три промежуточных продукта: в порядке их возникновения, это нитрит (NO 2), окись азота (NO) и закись азота (N 2 O). То есть денитрификация (как и нитрификация) - это процесс многоступенчатый, и его промежуточные продукты, и в частности нитрит, токсичны. Если денитрификация происходит не до конца, качество воды становится для рыб много хуже, чем до этого процесса. Существуют и еще два других процесса, которые могут происходить в аквариуме. Это диссимилятивное и ассимилятивное поглощение нитрата. Оба они опасны, т.к. производят аммоний. Фактически это полная противоположность нитрификации - нитрат редуцируется в нитрит, который затем редуцируется в гидроксиламин (NH 2 OH) и затем в аммоний.

За все эти превращения ответственны бактерии. Важное различие между нитрификацией и денитрификацией заключается в видах бактерий, которые участвуют в этих процессах. Нитрификация производится так называемыми автотрофными бактериями. Это означает, что они получают углерод, необходимый для роста, из неорганических веществ, в частности, из углекислого газа. Денитрифицирующие бактерии (Bacillus, Denitrobacillas, Micrococcus, Pseudomonas и др.) являются гетеротрофными, то есть получают углерод из органических источников, как сахароза, глюкоза, спирты, органические кислоты, аминокислоты и др. (существует, впрочем, особый вид фильтра-денитратора, в котором для переработки нитрата в азот используется серные бактерии - автотрофы, см. 3-ю часть статьи). Суть полезного действия бактерий-денитрифаторов в том, что в условиях анаэробной, т.е. крайне бедной кислородом среды, они извлекают необходимый для дыхания кислород из нитрата, при этом редуцируя его. Денитрифицирующие бактерии – это анаэробные бактерии. Хотя, если быть совсем корректным, есть бактерии, которые являются факультативными анаэробами и в зависимости от содержания в среде кислорода способны черпать его как из вне, так и извлекать из нитратов (поэтому, кстати, считается, что приспособление денитрифицирующих бактерий к анаэробным условиям - вторичного происхождения). Но в целом, как об этом пишет Мартин Сандер, "можно исходить из того, что кислород препятствует денитрификации".

Таким образом, для успешного протекания процесса денитрификации нужно соблюдение трех условий: наличие в аквариуме нитратов, бедная кислородом среда и наличие органических углеродосодержащих веществ. Углерод используется бактериями как основное питательное средство, в то время как потребность в кислороде удовлетворяется за счет нитрата. Четвертое условие, о котором позже будет рассказано, - это достаточно низкий окислительно-востановительный (или как его обычно называют, редокс) потенциал.

Реакцию денитрификации в классическом ее виде можно выразить уравнениями:

первая ступень 3NO 3 - + CH 3 OH = 3NO 2 - + CO 2 + 2H 2 O и

вторая ступень 2NO 2 - + CH 3 OH = N 2 + CO 2 + H 2 O + 2OH - .

Как видно из уравнений, нитраты при этом не сразу трансформируются в газообразный азот, а прежде образуются токсичные нитриты. И лишь на второй ступени азот удаляется из цикла путем образования газообразного азота. Добиться, чтобы эти процессы происходили контролируемо, - непростая задача. Во всяком случае, это гораздо сложнее, чем наладить биологическое преобразование аммиака в нитрат. Кроме того, с денитрификацией связано немало заблуждений, в том числе исходящих от аквариумистистов, использующих эти технологии на практике. Процесс денитрификации не всегда происходит безмятежно. Наряду с полезным действием по удалению нитратов, в ходе денитрификационных процессов могут образовываться другие вещества, чрезвычайно вредные - метан (СН 4) и сероводород (H 2 S), поскольку наряду денитрифицирующими бактериями в анаэробные процессы подключаются и другие виды микроорганизмов, в частности метанобразующие археи и сульфатвосстанавливающие бактерии, тоже анаэробы. В частности, такое происходит, при недостатке нитратов, либо очень низком редокс-потенциале. Тогда анаэробная микрофлора начинает удовлетворять потребность в кислороде за счет других кислородосодержащих химических соединений - с выделением сероводорода и метана, оба газа токсичны. Метанобразующие бактерии могут синтезировать метан, используя в качестве энергии реакции окисления углекислого газа (СО 2). В природных водоемах метан является одним из конечных продуктов разложения органических веществ в донной анаэробной зоне и образуется узкоспециализированной группой строгих анаэробов - метанобразующих архей. Сульфатвосстанавливающие бактерии забирают кислород из сульфатов (SO 4 2-). В этом процессе, который называется десульфуризация, возникает сероводород, который известен запахом тухлых яиц. Также выше упомянуты биопроцессы диссимилятивного и ассимилятивного восстановления нитратов до гидроксиламина (NH 2 OH) и затем аммония. Способностью к этому обладают различные бактерии, а также некоторые актиномицеты и грибы. Понятно, что всеми этими процессами, которые также происходят в природе, трудно управлять в аквариуме, стимулируя лишь полезные и препятствуя вредным процессам.

Теперь несколько слов об окислительно-восстановительном потенциале - мере способности химического вещества присоединять электроны (восстанавливаться). Его величина определяет равновесие между восстановительными и окислительными реакциями в воде. Другое название - редокс-потенциал (от англ. redox - reduction-oxidation reaction). Этот показатель связан с уровнем загрязненности аквариумной воды органическими веществами, а также с возрастом аквариума. Недавно запущенный аквариум характеризуется, как правило, высокими значениями редокс потенциала, затем, по мере старения аквариума, его редокс-потенциал снижается. Поддерживать редокс-потенциал на определенном уровне можно путем регулярного ухода за аквариумом, чистки грунта, подмены воды и т.д. Высокий положительный редокс-потенциал (в нормальном аквариуме он составляет 200 – 400 mV (минивольт)) указывает на доминирование окислительных реакций над восстановительными. Отрицательный редокс потенциал указывает на отсутствие кислорода в воде, что смертельно для большинства беспозвоночных. А вот для нормального течения процесса денитрификации окислительно-восстановительный потенциал должен быть отрицательным и удерживаться в пределах примерно от -50 до -250 mV. Таким образом, реакция денитрификации не может происходить непосредственно аквариумной воде, а требует специальных анаэробных зон, которые могут образовываться, например, в грунте или фильтре. Если же окислительно-восстановительный потенциал будет выше, чем -50 mV (но меньше нуля), то процесс денитрификации скорее всего остановится на стадии образования нитритов. А если он упадет ниже -300 mV, то бактерии возьмутся за сульфаты.

Следующая проблема - наличие достаточного количества органического углерода, необходимого для этого виды бактерий. Органических веществ, находящихся в аквариуме, не достаточно для поддержки процесса, поэтому требуется вносить их дополнительно. В выше приведенных уравнениях в качестве органического вещества фигурирует метанол, однако на практике метиловый спирт - яд. Концепция классического углеродного нитратредуктора подразумевает использование лактозы. Еще вариант - этиловый спирт или водка. Кстати, несколько лет назад очень популярной была идея запуска денитрификации посредством внесения в аквариум водки. Правда, отваживались на это не многие, но обсуждали активно. На самом деле, как пишет об этом Дитер Брокманн, эта технология не имеет ничего общего с денитрификацией, то есть расщеплением нитратов для дыхания бактерий, а скорее ближе к ассимиляции и производству биомассы. "Алкоголем, в отличие от денитрифицирующих фильтров, мы стимулируем преимущественно аэробных бактерий и только затем анаэробных бактерий, играющих менее важную роль. Под ассимиляцией подразумевается усвоение нитратов и фосфатов, например, водорослями. Последние используют оба вещества для получения азота и фосфора, необходимых для собственного обмена веществ и, соответственно, жизнеобеспечения и роста. Из этого следует вывод, что усиленный рост водорослей влияет на понижение концентрации фосфатов и нитратов в аквариуме. Раньше этот эффект использовали в водорослевых фильтрах для редукции нитратов. Подливая водку в аквариум, мы тем самым поддерживаем ассимиляцию, стимулируя, правда, не водоросли, а бактерии. Мы предоставляем им источник легко перерабатываемой пищи - этанол в водке. За счет наращивания биомассы уровень содержания фосфатов и нитратов в аквариумной воде снижается. Однако практика показала, что денитрификация может протекать только в субстрате, содержащем анаэробные зоны. И о его наличии тоже надо позаботиться".

И еще. Нужно сбалансировать систему так, чтобы промежуточные продукты денитрификации не накапливались. Как выше указывалось, при переработке нитрата сначала производится нитрит, он токсичен и накапливаться в аквариуме не должен. Опасность роста концентрации нитрита - одно из слабых мест денитрифицирующих систем. Ну и чтобы совсем сгустить краски, надо напомнить, что кроме нитратов в аквариуме еще есть фосфаты и наверное еще много разных веществ и соединений, которые нельзя проконтролировать с помощью стандартного набора аквариумных тестов, из-за чего дискусы в зацикленном с помощью денитратора аквариуме вдруг становятся вялыми и отказываются нереститься. Селективным устранением нитратов мы добиваемся только видимости создания системы замкнутого цикла.

Впрочем все это не означает, что денитрификация, в принципе, недоступна или не имеет смысла для аквариумистики. Нитратные фильтры уже много лет успешно используются в морских аквариумах и сейчас начали внедряться для обслуживания в пресноводных. Но более всего хочется надеяться, что денитрификация все еще представляет собой перспективную область для исследований, и последнее слово в этом вопросе еще не сказано.

Литература

Аникштейн С. Нитраты – такие вредные и такие полезные.
Аникштейн С. Не пренебрегайте аэрацией.
Бейли М. Бергесс П. Золотая книга аквариумиста.
Берсенев А. Загадка биофильтра.
Брокман Д. Нитраты.
Ванюшин И.И. Нужна ли в аквариуме фильтрация?
Ванюшин И.И. Покупаем аквариумы.
Горюшкин С. Обратный осмос в системе фильтрации аквариума.
Горюшкин С. Фильтрация и дискусы.
Гусев М.В., Минеева Л.А. Микробиология.
Дубиновский М. и др. Вода в аквариуме.
Дубиновский М. и др. Фильтрация в аквариуме.
Дубиновский М. Запуск аквариума.
Информационные материалы по морской аквариумистике, разные.
Кубасов А.А. Цеолиты – кипящие камни.
Ковалев В. В аквариуме что-то не так??? Попробуем разобраться!
Ковалев В. Пять очень важных параметров качества воды и как ими пользоваться не запутавшись.
Ковалев В. Состав аквариумной воды: основные проблемы.
Кусков В. Как создавать и поддерживать биологическое равновесие.
Сандер М. Техническое оснащение аквариума.
Серга Т. Nitrospira – нитрит-окисляющие бактерии в аквариумах.
Спиридонов М. Цеолит в аквариуме. Польза или вред?
Телегин А. Устройство открытых фильтров.
Успех с нитратным фильтром. Пер. А.И. Горюшкина.
Фролов Ю., Юдаков В. Основы биологической фильтрации.
Хахинов В.В. и др. Гидрохимия экстремальных водных систем с основами гидробиологии.
Хованек Т. Что такое денитрификация?
Хомченко И.Г. и др. Современный аквариум и химия.
Цигельницкий Е. Фитофильтрация.
Шереметьев И. Орошаемый фильтр для аквариума.
Элбакян В. Жуть нитратная.
Юдаков В. Краткие основы аквариумной фильтрации.
Ярцев В. Заметки по поводу биошаров (Bioballs).
Ярцев В. Фильтры с орошением (sump).
Brockmann D. Fische und Korallen im Meer und im Aquarium.
Holmes-Farley R. Chemistry and the aquarium: Nitrate in the reef aquarium.
Foster С. Exclusive: Hagen announces launch of Fluval G filter.

© Е. Грановский, 2009-2010

Круговорот углерода в мире микроорганизмов. Зависимость судьбы углерода от наличия кислорода в окружающей среде. Полное и неполные окисления. Автотрофы и гетеротрофы. Метаногены, метилотрофы

Взаимосвязь живых организмов на Земле особенно ярко выражена в круговороте углерода . Атмосферный воздух содержит около 0,03% С0 2 , но продуктивность зеленых растений настолько велика, что весь запас углекислоты в атмосфере был бы истрачен за 20 лет. Фотосинтез бы прекратился, если бы микроорганизмы, растения и животные не обеспечивали возвращение С0 2 в атмосферу в результате непрерывной минерализации органических веществ. Циклические превращения углерода и кислорода реализуются главным образом через два разнонаправленных процесса: кислородный фотосинтез и дыхание (либо горение в небиологических реакциях).

При кислородном фотосинтезе аэробные цианобактерии и зелёные растения основную часть окисленной формы углерода (СО 2) переводят в восстановленное состояние, характерное для органических соединений (например, глюкозу), а восстановленную форму кислорода (Н 2 О) окисляют до О 2 . Хотя анаэробные пурпурные и зелёные бактерии могут восстанавливать С0 2 до органических веществ, окисляя соединения: NH 3 , NO 2 , Н 2 , Fe 2+ , восстановленные соединения серы, вклад этих процессов в общую фиксацию СО 2 , незначителен. В результате фотосинтетической фиксации СО 2 образуются сахара и другие соединения. Основная масса фиксированного углерода растений откладывается в виде полимерных углеводов (крахмал, целлюлоза). Поэтому сахара играют ведущую роль в питании всех живых организмов, нуждающихся в органической пище (организмы-гетеротрофы), и служат предпочтительными питательными веществами для большинства гетеротрофных микроорганизмов.

В присутствии кислорода полное окисление органических веществ до СО 2 осуществляют многие аэробные (псевдомонады, бациллы) и факультативно анаэробные (актиномицеты) бактерии, грибы, а также животные. В качестве примеров неполного окисления можно привести окисление сахаров уксуснокислыми бактериями (Acetobacter, Gluconobacter) с образованием ацетата, образование лактата грибами порядка Mucorales (Rhizopus oryzae, R. nigricans и др.), образование глюконовой кислоты аспергиллами и пенициллами.

В анаэробных условиях органические соединения расщепляются путём брожения (дрожжи, молочнокислые бактерии, пропионовокислые бактерии, бактерии семейства Enterobacteriaceae), либо окисляются в процессе анаэробного дыхания при наличии акцепторов водорода. В роли акцепторов водорода выступают нитраты, сульфаты, карбонаты, фумараты, Fe 3+ : соответственно выделяют денитрифицирующие (виды родов Pseudomonas, Achromobacter, Bacillus и Micrococcus), сульфатредуцирующие (виды рода Desulfotomaculum , Desulfovibrio , Desulfobacter, De–sulfococcus, Desulfosarcina, Desulfonema) , метанобразующие бактериями. Метанобразующие бактерии (Methanobacterium, Melhanococcus, Methanosarcina) - строгие анаэробы, составляющие последнее звено анаэробной пищевой цепи. Выделяемый ими метан в аэробных условиях может окислятся до С02 метилотрофными бактериями (Methylomonas, Methytosinus, Melhylococcus).

Метилотрофы

Среди прокариотных и эукариотных микроорганизмов довольно широко распространена способность использовать для роста многие соединения, содержащие один атом углерода, более восстановленные, чем CO 2 (CO, метан (CH 4), метанол (CH 3 OH), формальдегид (HCOH), муравьиная кислота (HCOOH), метиламин (CH 3 NH 2), хлорметан (CH 3 Cl), цианистый калий (KCN)), а также соединения, содержащие больше одного углеродного атома, но не имеющие С-С-связей (ди- и триметиламины [(CH 3) 2 NH, (CH 3) 2 N], диметилсульфид [(CH 3) 2 S], метилформиат (CH 3 COOH) и др). В большинстве из них углерод представлен в виде метильной группы, поэтому микроорганизмы, использующие эти соединения, получили название метилотрофов.

Использовать C 1 -соединения могут многие аэробные и анаэробные прокариоты. Среди анаэробов такой способностью обладают, например, сульфатвосстанавливающие эубактерии, метанобразующие архебактерии, многие типичные хемо- и фототрофные эубактерии. К метилотрофам относят облигатно аэробные эубактерии, обладающие способностью использовать в качестве единственного источника углерода и энергии одноуглеродные соединения. Это различные грамположительные и грамотрицательные формы - представители Pseudomonas, Bacillus, Hyphomicrobium, Protaminobacter, Arthrobacter, Nocardia и др.

В отношении способа питания различают две основные группы метилотрофов: факультативные и облигатные. Факультативные метилотрофы наряду с одноуглеродными могут использовать и некоторые полиуглеродные соединения. Группа облигатных метилотрофов включает эубактерии, использующие только одноуглеродные соединения.

В IX издании Определителя бактерий Берги облигатные и факультативные метилотрофы выделены в семейство Methylococcaceae, включающее роды Methylococcus и Methylomonas. Основной признак - способность использовать метан в качестве единственного источника углерода и энергии в аэробных или микроаэробных условиях.

Метилотрофы, отнесенные к семейству Methylococcaceae, грамотрицательные эубактерии с разной морфологией и размерами клеток, подвижные или неподвижные. Некоторые штаммы образуют цисты. Характерной особенностью при росте на метане является наличие в клетке развитой системы внутрицитоплазматических мембран, которые могут быть разделены на два типа: внутрицитоплазматические мембраны I типа представлены стопками плотно упакованных везикулярных дисков, распределенных по всей цитоплазме; внутрицитоплазматические мембраны II типа имеют вид ламелл, расположенных по периферии клетки.

Помимо метана в качестве единственного источника углерода и энергии облигатные метилотрофы могут использовать метанол, формальдегид и другие C 1 -соединения, а факультативные - также C 2 -, C 4 -кислоты, этанол, глюкозу. Использование метилотрофами C 1 -соединений в конструктивном и энергетическом метаболизме привело к формированию у них специфических путей ассимиляции и диссимиляции этих соединений.

Процесс полного окисления метана может быть представлен в виде следующей схемы.

Первый этап - окисление метана до метанола катализируется метанмонооксигеназой в реакции:

CH 4 + O 2 + H 2 A = CH 3 OH + A + H 2 O.

где O 2 - молекулярный кислород, а H 2 A - восстановитель.

Описаны две формы метанмонооксигеназы: связанная с внутрицитоплазматическими мембранами и растворимая. Донором электронов для первой предположительно может быть восстановленный цитохром с или НАД-H 2 , образующийся в результате обратного электронного транспорта, для второй - только НАД(Ф)-H 2 или соединения, которые окисляются с его образованием. Остальные этапы окисления катализируются соответствующими дегидрогеназами, различающимися строением, природой акцепторов электронов и другими параметрами.

Окисление метана и связь энергетического и конструктивного метаболизма у метилотрофов: Ф 1 - метанмонооксигеназа; Ф 2 - метанолдегидрогеназа; Ф 3 - формальдегиддегидрогеназа; Ф 4 - формиатдегидрогеназа; ассимиляционные циклы: 1 - рибулозомонофосфатный, 2 - сериновый, 3 - восстановительный пентозофосфатный

Формальдегид у метилотрофов является ключевым метаболитом, на уровне которого расходятся конструктивные и энергетические пути. Часть формальдегида превращается в вещества клетки по специфическим для этих эубактерий ассимиляционным циклическим путям, большая часть окисляется до CO 2 в линейной последовательности реакций через формиат.

Дыхательные цепи метилотрофов по составу переносчиков и их локализации на мембране похожи на таковые большинства аэробных эубактерий, что предполагает возможность функционирования у них трех пунктов сопряжения. В окислительном метаболизме C 1 -соединений участвуют НАД, флавины, хиноны, цитохромы типа b, c, a, o .

Окисление метанола до формальдегида, катализируемое ферментом, содержащим в качестве простетической группы особый хинон, сопровождается передачей электронов в дыхательную цепь на уровне цитохрома c . Это приводит к синтезу одной молекулы АТФ, т. е. указывает на функционирование только третьего пункта сопряжения.

Окисление формальдегида и формиата, зависимое от НАД, позволяет предполагать, что перенос пары электронов может быть связан с тремя трансмембранными перемещениями протонов. Полученные экспериментальные данные указывают, однако, на меньшие выходы АТФ. Вопрос о том, на каком уровне передаются электроны от формальдегида и формиата в дыхательную цепь, не вполне ясен.

У метилотрофов функционируют циклические пути ассимиляции C 1 -соединений, ответственные за превращения их в вещества клетки: восстановительный пентозофосфатный, рибулозомонофосфатный и сериновый. В восстановительном пентозофосфатном цикле происходит ассимиляция CO 2 , образующейся при окислении C 1 -соединений. У метилотрофов этот путь не имеет широкого распространения и обнаружен только у представителей, способных расти автотрофно, а также у тех, кто может использовать формиат.

В рибулозомонофосфатном и сериновом циклах обеспечивается использование в биосинтетических процессах формальдегида, образуемого при окислении разных C 1 -соединений. Первая реакция рибулозомонофосфатного пути - акцептирование формальдегида молекулой рибулозо-5-фосфата, приводящее к образованию гексулозо-6-фосфата, который изомеризуется затем во фруктозо-6-фосфат. Ферменты, катализирующие обе реакции, специфичны для данного цикла. Далее возможны разные варианты. По одному из них фруктозо-6-фосфат подвергается фосфорилированию. Образовавшийся фруктозо-1,6-дифосфат расщепляется на две триозы: 3-фосфоглицериновый альдегид и фосфодиоксиацетон. 3-ФГА и фруктозо-6-фосфат участвуют в серии реакций, приводящих к регенерации акцептора формальдегида - рибулозо-5-фосфата. Эти реакции аналогичны таковым восстановительного пентозофосфатного цикла. Три оборота рибулозомонофосфатного цикла приводят к синтезу молекулы фосфодиоксиацетона, используемого в биосинтетических процессах.

Сериновый цикл существенно отличается от предыдущего пути ассимиляции формальдегида природой интермедиатов и ферментами. Ключевая реакция этого пути - конденсация формальдегида и глицина в присутствии тетрагидрофолиевой кислоты, приводящая к образованию серина. Последний в реакции трансаминирования превращается в оксипировиноградную кислоту, последовательное восстановление и фосфорилирование которой приводит к образованию 3-ФГК. Одна часть 3-ФГК используется для синтеза вещества клетки, другая превращается в фосфоенолпировиноградную кислоту. Последующее карбоксилирование ФЕП приводит к синтезу молекулы щавелевоуксусной кислоты. Эта реакция примечательна тем, что в сериновый цикл вовлекается CO 2 . Последующая серия реакций приводит к регенерированию глицина, и цикл замыкается.

Ассимиляция формальдегида через рибулозомонофосфатный цикл характерна для метилотрофов, имеющих мембранную организацию I типа, а через сериновый - для метилотрофов с системой внутрицитоплазматических мембран II типа.

ЦТК в системе катаболических путей не занимает ведущего места. У ряда облигатных метилотрофов он не "замкнут". Если даже содержит все ферменты, активность некоторых из них невысока.

Изучение этой специфической группы эубактерий привело к заключению о ее близости к автотрофам. Это проявляется как в способности метилотрофов синтезировать все вещества клетки из С 1 -соединений, так и функционированию развитого у них механизма ассимиляции CO 2 в восстановительном пентозофосфатном цикле.

Метилотрофы - обитатели водоемов и почв различного типа, где идут процессы с образованием одноуглеродных соединений. Их выделяют из сточных вод, с гниющих растительных остатков, из рубца жвачных животных. Интерес к изучению метилотрофов связан не только с особенностями их метаболизма, но и с перспективами их практического использования: метилотрофы характеризуются активным ростом, высокими выходами биомассы, большим содержанием полноценного белка в клетке; являются эффективными продуцентами различных веществ. В биосфере метан и другие С 1 -соединения поддерживаются на постоянном уровне главным образом за счет деятельности метилотрофов.

Метаногены.

Это морфологически разнообразная группа (кокки, палочки, сарцины, некоторые способны формировать нити или пакеты и др. Клетки неподвижные или передвигающиеся с помощью перитрихиально или полярно расположенных жгутиков), объединяемая 2-мя общ.признаками: облигатным анаэробиозом и способностью образовывать метан. В IX издании Определителя бактерий Берги группа разделена на 3 порядка: Methanobacteriales, Methanococcales, Мethanomicrobiales. У представителей рода Methanosarcina в клетках найдены газовые вакуоли. Для некоторых характерна развитая система внутриклеточных элементарных мембран, являющихся результатом разрастания и впячивания в цитоплазму ЦПМ и сохраняющих с ней связь. У этой группы архебактерий обнаружены клет.стенки 3-х типов: из псевдомуреина, из белковых глобул и гетерополисахаридной природы. Описан микоплазмоподобный метаноген, выделенный в род Methanoplasma, не имеющий кл.стенки.

Метаногены – строгие анаэробы. Рост нек.видов полностью подавляется при наличии молекулярного O 2 . Описаны виды с низкой чувствительностью к O 2 - в их клетках найдена супероксиддисмутаза.

Большинство имеет температурный оптимум для роста=30-40◦С, т.е. являются мезофилами. Но есть виды, у к-ых опт.зона сдвинута в сторону более низких темп.25◦С или высоких – 55-65◦С. Есть и термофилы: Methanothermus fervidus,растущий при 55-97◦С.

Все метаногены – нейтрофилы с оптимал. рН=6,5-7,5. Встречаются галлофилы (для роста нужен NaCl).

Универсал.источником С и Е для них является газовая смесь Н 2 и СО 2 . Следующими по распространению служат формиат, ацетат, метанол, метиламины и CO. В качестве ист. N используют аммонийный азот или нек.аминокислоты. Ист. S - сульфаты, сульфид и серосодержащие аминокислоты.

Коструктивный метаболизм . Е получают, осуществляя реакцию:

4Н 2 + СО 2 =2Н 2 О + СН 4

СО 2 не только единственный источник С, но и конеч.акцептор е при окислении водорода.

Фиксация СО 2 происходит по нециклическому ацетил-КоА-пути, где ключевым промежуточным соединением явл-ся ацетил-КоА, далее по схеме:

Биосинтез метана . Восстановление CO 2 до CH 4 требует переноса 8 электронов. Образующиеся на этом пути промежуточные продукты находятся не в свободном состоянии, а остаются связанными с переносчиками. Согласно предложенной модели на первом этапе CO 2 связывается с переносчиком углерода, образуя карбоксипроизводное (X 1 -COOH), которое восстанавливается до формилпроизводного (X 1 -CHO). Второй этап метаногенеза включает перенос формильной группы на другой переносчик (Х 2), который проводит C 1 -группу через две последовательные восстановительные реакции, приводящие к образованию метилпроизводного (X 2 -CH 3). На уровне образования метиленпроизводного (X 2 -CH 2) в процесс метаногенеза включается экзогенный формальдегид. Соединения, содержащие метильные группы (CH 3 OH, CH 3 COOH, CH 3 NH 2 и другие метиламины), подключаются на уровне метилпроизводного. В этой же точке происходит разветвление анаболических и катаболических путей. На третьем конечном этапе метаногенеза, наиболее изученном, метильные группы с переносчика поступают на кофермент М (КоМ-SH). Образуется метил-КоМ. Далее следует его восстановление, сопровождающееся распадом комплекса и выделением CH 4 . Обе реакции катализируются метилредуктазной системой, представляющей сложный мультиферментный комплекс, в состав которого помимо фермента входят кофермент М, фактор F 430 . Для активности системы необходимы АТФ, ионы Mg 2+ и еще не идентифицированные кофакторы.

Место обитания : анаэробная зона разных водоемов, богатых орг.веществами, в иловых отложениях рек и озер, в болотах, заболоченных почвах, в осадочных слоях морей и океанов. Также обитатели пищевар.тракта животных и человека, важный компонент микрофлоры рубца жвачных животных. Метаногены обеспечивают протекание в природе анаэробного разложения орг.соединений, в 1 очередь – целлюлозы. Метаногены также представляют практический интерес как продуценты витамина В 12 и газообразного топлива – метана.

Превращение различных форм азота микроорганизмами. Аммонификация белков. Ассимиляционная и диссимиляционная нитратредукция. Аммонификация нитрата. Азотфиксация. Нитрификация.

Нитрифицирующие бактерии

Получают энергию в результате окисления восстановленных соединений азота (аммиака; азотистой кислоты). Впервые чистые культуры этих бактерий получил С. Н. Виноградский в 1892 г., установивший их хемолитоавтотрофную природу. В IX издании Определителя бактерий Берги все нитрифицирующие бактерии выделены в семейство Nitrobacteraceae и разделены на две группы в зависимости от того, какую фазу процесса они осуществляют. Первую фазу - окисление солей аммония до солей азотистой кислоты (нитритов) - осуществляют аммонийокисляющие бактерии (роды Nitrosomonas, Nitrosococcus, Nitrosolobus и др.):

NH 4 + + 1,5O 2 = NO 2 – + H 2 O + 2H + .

Вторую фазу - окисление нитритов до нитратов - осуществляют нитритокисляющие бактерии, относящиеся к родам Nitrobacter, Nitrococcus и др.:

NO 2 – + 1/2O 2 = NO 3 – .

Группа нитрифицирующих бактерий представлена грамотрицательными организмами, различающимися формой и размером клеток, способами размножения, типом жгутикования подвижных форм, особенностями клеточной структуры, молярным содержанием ГЦ-оснований ДНК, способами существования.

Все нитрифицирующие бактерии - облигатные аэробы; некоторые виды - микроаэрофилы. Большинство - облигатные автотрофы, рост которых ингибируется органическими соединениями в концентрациях, обычных для гетеротрофов. Основным источником углерода остается CO 2 , ассимиляция которого осуществляется в восстановительном пентозофосфатном цикле. Только для некоторых штаммов Nitrobacter показана способность к медленному росту в среде с органическими соединениями в качестве источника углерода и энергии.

Процесс нитрификации локализован на ЦПМ и внутрицитоплазматических мембранах. Ему предшествует поглощение NH 4 + и перенос его через ЦПМ с помощью Сu-содержащей транслоказы. При окислении аммиака до нитрита атом азота теряет 6 электронов. Предполагается, что на первом этапе аммиак окисляется до гидроксиламина с помощью монооксигеназы, катализирующей присоединение к молекуле аммиака 1 атома O 2 ; второй взаимодействует, вероятно, с НАДH 2 , что приводит к образованию H 2 O:

NH 3 + O 2 + НАДH 2 = NH 2 OH + H 2 O + НАД + .

NH 2 OH + O 2 = NO 2 – + H 2 O + H + .

Электроны от NH 2 OH поступают в дыхательную цепь на уровне цитохрома c и далее на терминальную оксидазу. Их транспорт сопровождается переносом 2 протонов через мембрану, приводящим к созданию протонного градиента и синтезу АТФ. Гидроксиламин в этой реакции, вероятно, остается связанным с ферментом.

Вторая фаза нитрификации сопровождается потерей 2 электронов. Окисление нитрита до нитрата, катализируемое молибденсодержащим ферментом нитритоксидазой, локализовано на внутренней стороне ЦПМ и происходит следующим образом:

NO 2 – + H 2 O = NO 3 – + 2H + + 2е – .

Электроны поступают на цитохром a 1 и через цитохром c на терминальную оксидазу aa 3 где акцептируются молекулярным кислородом. При этом происходит перенос через мембрану 2H + . Поток электронов от NO 2 – на O 2 происходит с участием очень короткого отрезка дыхательной цепи

Многие хемоорганогетеротрофные бактерии, принадлежащие к родам Arthrobacter, Flavobacterium, Xanthomonas, Pseudomonas и др., способны окислять аммиак, гидроксиламин и другие восстановленные соединения азота до нитритов или нитратов. Процесс нитрификации этих организмов, однако, не приводит к получению ими энергии. Изучение природы этого процесса, получившего название гетеротрофной нитрификации, показало, что, возможно, он связан с разрушением образуемой бактериальными культурами перекиси водорода с помощью пероксидазы. Образующийся при этом активный кислород окисляет NH 3 до NO 2 – .

Нитрифицирующие бактерии обнаружены в водоемах разного типа и в почвах, где они, как правило, развиваются совместно с бактериями, жизнедеятельность которых приводит к образованию исходного субстрата нитрификации - аммиака.

Процесс нитрификации, являясь важным звеном в круговороте азота в природе, имеет как положительные, так и отрицательные стороны. Переведение азота из аммонийной формы в нитратную способствует обеднению почвы азотом, поскольку нитраты легко вымываются из почвы. В то же время нитраты - хорошо используемый растениями источник азота. Связанное с нитрификацией подкисление почвы улучшает растворимость и, следовательно, доступность некоторых жизненно необходимых элементов, в первую очередь фосфора и железа.

Нитрификация

Вводные пояснения. Под нитрификацией понимают про­цессы окисления аммиака до нитрита и нитрата. Эти превра­щения идут в две фазы. Вызывают их нитрифицирующие бак­терии главным образом двух родов:

Nitrosomonas: NH + 4 + l"/ 2 O 2 → NO - 2 + 2H + H 2 O

Nitrobacter: NO - 2 + "/ 2 О 2 → NO - 3

Энергию, выделяющуюся при окислении аммиака и ни­трита, нитрификаторы используют для ассимиляции диоксида углерода. Бактерии, осуществляющие данный процесс, отно­сятся к хемолитоавтотрофам и представляют собой облигатных аэробов.

Первая фаза нитрификации. Для выявления бактерий первой фазы нитрификации и определения относительного количества их в почве используют метод Виноградского на гелевых пластинах (см. 7.2.1).

Промытые и прокипяченные пластины кремнекислого ге­ля (в чашках Петри) пропитывают 3-5 мл среды Виноградско­го. Минеральная основа среды имеет следующий состав (г/200 мл дистиллированной воды): (NH 4) 2 SO 4 - 2,0; К 2 НРО 4 - 1,0; MgSO 4 - 0,5; NaCl - 0,4; FeSO 4 7Н 2 О - 0,4; MgCO 3 или СаСО 3 - 5,0. Источник азота (NH 4) 2 SO 4 - 2 г. Лучшие резуль­таты получают при замене (NH 4) 2 SO 4 на фосфорно-аммоний-но-магниевую соль - NH 4 MgPO 4 · MgCO 3 ; кроме того, важно растереть СаСО 3 перед приготовлением среды пестиком в сте­рильной ступке.

Питательную среду в чашках упаривают при 40-50 ºС до образования белой блестящей эмалевой поверхности, возни­кающей за счет равномерного распределения слоя MgCO 3 или СаСО 3 . Слой любого из этих веществ служит индикатором процесса нитрификации, так как в тех местах на геле, где раз­виваются нитрифицирующие бактерии, появляются зоны рас­творения карбонатов, в которых эти микроорганизмы и обнаруживаются.

По эмалевой поверхности пластин раскладывают опреде­ленное число комочков свежей почвы, для чего берут два часо­вых стекла и стерилизуют их фламбированием. Затем в одно часовое стекло помешают почву, а в другое наливают дистил­лированную воду. Палочкой с оттянутым концом, предвари­тельно слегка проведя ее над огнем и смочив водой, захватыва­ют комочки почвы (диаметром 1-2 мм) и по трафарету рас­кладывают их по поверхности эмалевых пластин.

Чашки помещают во влажную камеру и ставят в термо­стат при 28-30 ºС. Через некоторое время (спустя 7, 14, 21 сут), в зависимости от активности нитрифицирующих бактерий, вокруг отдельных комочков почвы появляются зоны растворения мела, свидетельствующие об обрастании комочков почвы ни­трифицирующими бактериями.

Чашки вынимают и подвергают анализу: определяют сте­пень обрастания комочков почвы нитрифицирующими бакте­риями (в %), изучают морфологию их представителей и про­дукты жизнедеятельности.

Степень обрастания комочков почвы определяют следую­щим образом. Общее число комочков почвы, разложенных на чашке, принимают за 100%. Затем подсчитывают число комоч­ков почвы, давших зоны растворения мела, и устанавливают, какой процент они составляют от общего числа комочков поч­вы. Полученная величина не дает представления об абсолют­ном количестве нитрифицирующих бактерий в почве. Однако если сопоставить степени обрастания ими комочков разных почв, то этот показатель позволит судить о том, в какой почве содержится больше нитрифицирующих бактерий.

Чтобы определить продукты жизнедеятельности бакте­рий первой фазы нитрификации, чистым ланцетом вырезают по 3 кусочка геля из зон растворения мела и с мест, в кото­рых мел не растворился, помещают их изолированно в лунки белой фарфоровой пластины или в фарфоровые чашки. Сна­чала делают пробы с кусочками геля контрольных участков, где мел не растворился. Пробу на аммиак выполняют с реак­тивом Несслера: гель приобретает желтовато-оранжевую ок­раску, что свидетельствует о присутствии аммиака. Затем проводят пробу на нитрит с реактивом Грисса или цинк-иод-крахмалом, добавляя каплю 10%-ной серной кис­лоты: гель остается без изменений, что указывает на отсут­ствие нитрита.

Аналогичные пробы делают с кусочками геля, взятыми из зон растворения мела (или MgCO 3). В этом случае реакция на аммиак с реактивом Несслера отрицательная, т. е. гель не окрашивается. Реактив Грисса окрашивает гель в красный цвет, а цинк-иод-крахмал в кислой среде - в темно-синий, что свидетельствует о появлении азотистой кислоты.

Для знакомства с возбудителями первой фазы нитрификации из зон рас­творения мела берут иглой немного ма­териала и готовят окрашенный препарат. При его микроскопировании можно об­наружить овальные клетки, похожие на ноль, - Nitrosomonas (рис. 23) и Nitrosospira. Первые встречаются в старопахот­ных почвах, вторые - в целинных. В почвах Европы чаще встречаются Nitrosomonas europea

Вторая фаза нитрификации. Бактерии, вызывающие вто­рую фазу нитрификации, можно наблюдать на чашках с куль­турой первой фазы при более длительном их выдерживании в термостате. После исчезновения аммиака образовавшийся нитрит может окисляться до нитрата. В этом легко убедиться по исчезновению в среде нитрита и появлению нитрата. Для этого вырезают чистым ланцетом два кусочка геля, помещают их в фарфоровые лунки и об исчезновении нитрита судят по отрицательной реакции с реактивом Грисса или цинк-иод-крахмалом в кислой среде. С другим кусочком геля проводят пробу на нитрат с дифениламином в растворе кон­центрированной серной кислоты. В присутствии азотной кис­лоты гель приобретает темно-синий цвет (реакцию на нитрат с дифениламином делают только в отсутствие нитрита).

В препарате, приготовленном из мест растворения мела, взятого с поверхности чашки, в этот период можно обнару­жить возбудителей второй фазы нитрификации - мелкие, слегка искривленные и угловатые клетки Nitrobacter.

В связи с тем, что коэффициент полезного действия хемо­синтеза у нитрифицирующих бактерий очень низкий, рост их клеточной массы незначителен и на препаратах, приготовленных обычным способом, они обнаруживаются не всегда или с трудом.

Выявление бактерий обеих фаз нитрификации по Теппер . Для выявления бактерий обеих фаз нитрификации из культу­ры на гелевых пластинах был разработан специальный прием. В чашку, в которой прошли процессы нитрификации, осто­рожно вливают 6-8 мл водопроводной воды, бактерии при этом поднимаются на ее поверхность. Ели к поверхности воды прикоснуться чистым обезжиренным предметным стеклом, то на нем останутся нитрифицирующие бактерии. После суш­ки и фиксации препарат красят фуксином и рассматривают под микроскопом с иммерсионной системой.

На препаратах из чашек, в которых прошли первая и вторая фазы нитрификации, можно легко обнаружить предста­вителей обоих родов нитрифицирующих бактерий и их спутни­ков, в частности бактерии рода Bactoderma, всегда сопровождающие вторую фазу нитрификации.

Для специального наблюдения за процессом второй фазы нитрификации опыт также можно ставить на гелевых пласти­нах. Их пропитывают 2-3 мл питательной среды следующего состава (г/200 мл дистиллированной воды): NaNO 2 - 1,0; Na 2 CO 3 (безводный) - 1,0; NaCI – 0,5; K 2 HPO 4 - 0,5; MgSO 4 7H 2 O - 0,5; FeSQ 4 7H 2 O - 0,4.

Среду упаривают при 50 ºС до исчезновения свободной воды и по поверхности геля, как и в предыдущем опыте, рас­кладывают комочки почвы. Затем после 20-30 сут инкубации при 28-30 ºС анализируют, как было описано выше.