Inhibarea xantinei oxidazei ca o modalitate de a îmbunătăți rezultatele cardiovasculare. Scrisoare către editor Inhibitori ai xantinei oxidazei

O altă sursă enzimatică importantă de O~2 și H2O2 este xantina oxidoreductaza, descoperită pentru prima dată în laptele de vacă cu mai bine de 100 de ani în urmă. La mamifere, enzima în condiții normale este predominant sub formă de xantin dehidrogenază (EC 1.17.1.4, denumire sistematică „xantină: NA D + oxidoreductază”) și se poate transforma reversibil sau ireversibil în xantinoxidază (EC 1.17.3.2, denumire sistematică „ xantină: oxigen oxidoreductază”), rezultată, respectiv, din formarea de legături disulfură la reziduurile de cisteină Cys535 și Cys992 (posibil implicând sulfhidril oxidaze) sau proteoliză limitată cu proteaze dependente de calciu; Interesant este că la păsări enzima este prezentată numai sub formă de dehidrogenază. În timpul ischemiei de organ, se observă o transformare rapidă (în câteva minute) a xantin dehidrogenazei în xantin oxidază, iar ACM poate fi implicată în acest proces. Aceeași tranziție rapidă a enzimei la forma de oxidază este observată în timpul omogenizării țesuturilor, ceea ce complică semnificativ determinarea raportului real al diferitelor izoforme de enzime in vivo.

Orez. 14. Interconversii ale izoformelor de xantin oxidoreductază

Funcția fiziologică principală a enzimei este participarea la catabolismul purinelor; în acest caz, forma de xantin dehidrogenază utilizează în principal NAD+ ca acceptor de electroni, în timp ce forma de oxidază utilizează oxigen molecular (Fig. 15).

Folosind clonarea ADN-ului, a fost efectuată o analiză a aminoacizilor (aproximativ 1330 de aminoacizi) a enzimelor izolate de la om, șobolan, șoarece, pui și, de asemenea, din ficat de Drosophila; s-au dovedit a fi omologi în proporție de 90%. Gena care codifică xantinoxidaza este localizată pe cromozomul uman 22 (secțiunea 2p22) și pe cromozomul 17 de șoarece și conține 36 de exoni.

Expresia bazală a xantin-oxidoreductazei umane este scăzută (mai ales în comparație cu alte mamifere), dar transcripția enzimei este îmbunătățită semnificativ de citokine (interferon, interleukin-1, interleukin-6, TNF-a), hormoni (dexametazonă, cortizol, prolactină) , lipopolizaharidă, hipoxie ; hiperoxia acționează ca un regulator negativ. O modificare a presiunii parțiale a oxigenului acționează și la nivel post-transcripțional: activitatea xantin-oxidoreductazei în celulele endoteliale ale aortei bovine sub hipoxie a crescut de 2 ori fără a modifica expresia ARNm în 24 de ore (un efect similar de scădere). p02 a fost observată în fibroblaste), iar sub hiperoxie activitatea enzimei a scăzut mai repede decât rata sintezei sale de novo. Se presupune că o scădere a concentrației de oxigen promovează fosforilarea moleculei de xantin oxidoreductază, în urma căreia activitatea sa enzimatică crește.

Din punct de vedere structural, xantin oxidoreductaza este un homodimer; fiecare subunitate are o greutate moleculară de aproximativ 150 kDa și conține 3 domenii asociate cu cofactori specifici (Fig. 16). Domeniul N-terminal (aminoacizi 1-165) este format din două subdomenii, fiecare dintre ele include 1 centru fier-sulf coordonat cu 4 reziduuri de cisteină; domeniul intermediar (aminoacizii 226-531) conține un buzunar adânc de legare pentru FAD, care localizează inelul de flavină în imediata apropiere a Fe2-S2-HeHTpy; Domeniul C-terminal (aminoacizi 590-1332) este asociat cu un cofactor de molibden.

Proteoliza limitată a xantineoxi-

doreductaza de către tripsină duce la formarea a trei fragmente cu o greutate de 20, 40 și 85 kDa. Centrii de fier-sulf sunt localizați într-un fragment cu molecul scăzut de 20 kDa, FAD - într-un fragment de 40 kDa, un atom de molibden - într-un fragment cu moleculară înaltă de 85 kDa; toate cele trei fragmente sunt strâns interconectate și se dezintegrează numai în condiții de denaturare. Cofactorul de molibden este un derivat organic al pterinei (molibdopterina) care conține 1 atom de molibden pentacoordonat la doi atomi de ditiolen sulf, un alt atom de sulf și doi atomi de oxigen (Fig. 17).

Orez. 17. Structura cofactorului de molibden al xantinoxidazei

Xantina și hipoxantina sunt oxidate pe fragmentul de molibden, unde Mo(U1) este redus la Mo(1U); apoi electronii sunt transferați prin centrii fier-sulf ai enzimei către FAD și de la locul care conține FAD către NAD+ sau oxigen molecular (Fig. 16).

În lucrările timpurii, a fost discutată problema identității xantin-oxidazei și NADPH oxidazei fagocitelor, acum a fost strict stabilit că acestea sunt enzime diferite.

U diferite tipuri La animale, conținutul de xantin oxidoreductază variază semnificativ: de exemplu, în țesuturile oamenilor și iepurilor este mult mai mic decât în țesuturile șobolanilor și câinilor. Studiul conținutului de enzime în celule diferite iar tesuturile au aratat ca la animale (sobolani) se gaseste in cele mai mari concentratii in hepatocite, celule epiteliale si endoteliale. Datele privind conținutul de xantin oxidoreductază în țesuturile și organele umane sunt contradictorii, dar se reduc în principal la
la ceea ce este în cantitati mari enzima este prezentă în celulele ficatului și intestinului subțire, în timp ce în creier, inimă, plămâni, mușchii scheletici și rinichi nivelul acesteia este extrem de scăzut, ceea ce contrazice rolul presupus al xantin oxidazei în leziunile post-ischemice (reperfuzie). la aceste organe și țesuturi (vezi capitolul 3). Această discrepanță poate fi explicată prin existența în microvasele a unor țesuturi ale subpopulațiilor individuale de celule endoteliale care exprimă foarte nivel înalt activitatea enzimatică; Când se omogenizează fragmente mari de organe, xantina oxidoreductaza acestor subpopulații cantitativ mici este „responsabilă” pentru conținutul total al enzimei. În plus, s-a descoperit recent că xantina oxidoreductaza este localizată nu numai în citoplasmă, ci și pe suprafața exterioară a plasmalemei celulelor endoteliale și că în timpul ischemiei/reperfuziei, enzima poate fi eliberată din ficat și intestine în circulatia sistemica si se leaga de glicozaminoglicanii situati la suprafata celulelor endoteliale.

Cantități mici de xantin oxidoreductază se găsesc în fluidele extracelulare - de exemplu, în serul uman, activitatea sa variază de la 0 la 50 nmol acid uric / min / l, în timp ce aproape toată este sub formă de oxidază ca urmare a acțiunii proteazelor serice. . Nivelul enzimei extracelulare crește semnificativ în unele patologii, în special în bolile asociate cu afectarea ficatului - hepatită cronică, ciroză, icter obstructiv; în cazul hepatitei virale, în special în stadiul acut, se arată o creștere de 1000 de ori a concentrației enzimei în serul sanguin.

Sub formă de oxidază, enzima folosește oxigen molecular ca acceptor de electroni, rezultând formarea de O ~2 și H2O2; Mai mult, cu cât p02 este mai mare, cu atât se formează mai mult O2 și cu atât se formează mai puțin H202 (în condiții normale, aproximativ 70% din 02 se transformă în H202). În același timp, nu trebuie să uităm că în forma de xantin dehidrogenază enzima poate reduce și oxigenul, deși mai puțin eficient decât în forma de oxidază: în absența NAD+ și în prezența xantinei, V^ și Kmax ale acesteia pentru O2 sunt de 25, respectiv 600% din valorile caracteristice xantinoxidazei. Mai mult decât atât, ambele izoenzime (oxidază - într-o măsură mai mică) prezintă activitate NADH oxidază: electronii din NADH sunt transferați în FAD (Fig. 18), ca urmare a reducerii ulterioare a oxigenului, apar O2 și H2O2, în timp ce activitatea NADH oxidază. a izoformei dehidrogenazei poate ajunge la 40% din xantin dehidrogenază însăși. Reacția xantin oxidazei a evidențiat și formarea radicalului OH*, care, conform autorilor, apare ca urmare a reducerii ulterioare a H2O2.

Activarea xantin oxidazei în celulele endoteliale duce la inhibarea radicalilor NO, ceea ce îmbunătățește aderența fagocitelor circulante și agregarea trombocitelor; întrucât NO* reglează tonusul vascular, supraproducția de anion superoxid poate duce la hipertensiune arterială sistemică – într-adevăr, s-a demonstrat că administrarea intravenoasă de inhibitori ai xantinoxidazei (alopurinol, aloxantină, derivat de pirizalopirimidină) a dus la scăderea tensiunii arteriale la șobolanii hipertensivi spontan. În același timp, recent a fost descoperit un fapt paradoxal: s-a dovedit că la o presiune parțială scăzută a oxigenului, xantina oxidoreductaza poate servi ca sursă de NO*, sintetizând-o din nitrați și nitriți (atât organici, cât și anorganici) și folosind xantină. sau NADH ca sursă de electroni (Fig. 18), prin urmare, unii cercetători consideră enzima ca fiind o sursă importantă de vasodilatator NO* în țesutul ischemic. În acest caz este necesar

luați în considerare faptul că, în urma interacțiunii a doi produși ai activității enzimatice a xantin-oxidoreductazei, anion superoxid și oxid nitric, se formează peroxinitrit foarte reactiv, ceea ce demonstrează din nou dualitatea funcțiilor enzimei.

Se crede că generarea de ACM de către xantinoxidază este necesară pentru metabolismul fierului, reglarea tonusului vascular și proliferarea celulară. O importanță deosebită este acordată rolului enzimei în asigurarea imunității înnăscute. Rolul de barieră, antimicrobian al xantin-oxidoreductazei este susținut, în special, de localizarea acesteia - enzima este exprimată predominant în celulele epiteliale, în special în straturile bazale și apicale ale intestinului, pe suprafața luminală a celulelor epiteliale ale căilor biliare, în hepatocite. ; În straturile epiteliale ale tractului gastrointestinal al șobolanilor, bacteriile parțial distruse înconjurate de molecule de xantin oxidază sunt detectate histochimic.

Pentru nou-născuți, laptele matern servește ca o sursă suplimentară de enzimă care oferă protecție antimicrobiană. Xantina oxidoreductaza este o componentă proteică majoră a membranelor care înconjoară picăturile de grăsime din laptele proaspăt produs; fiind un derivat al membranelor apicale corespunzătoare ale glandelor secretoare, ele poartă aceleași antigene ca și celulele epiteliale. Deoarece bacteriile intestinale patogene se caracterizează printr-o afinitate pentru antigenele membranare ale celulelor epiteliale ale tractului gastrointestinal, ele se leagă, de asemenea, în mod eficient la antigeni similari din membranele globulelor de grăsime din lapte, intrând astfel în contact strâns cu xantina oxidoreductaza; Întărirea contactului este facilitată de afinitatea ridicată a enzimei pentru polizaharidele acide prezente în pereții celulari ai multor bacterii. Interesant este că activitatea xantinoxidazei din laptele matern la femei crește brusc în timpul alăptării, atingând un maxim (creștere de 50 de ori) în primele 15 zile după naștere și apoi scăzând la niveluri bazale până la sfârșitul primei luni. În același timp, conținutul de proteine al enzimei se modifică ușor, ceea ce indică reglarea sa post-translațională, care, în special, poate fi realizată prin introducerea unui cofactor de molibden. Astfel, în xantina oxidoreductaza din laptele femeilor care nu alăptează, mai puțin de 5% din locurile de legare a molibdopterinei sunt ocupate de un cofactor; pentru capre și oi în perioadele care nu sunt asociate cu alăptarea în primele săptămâni postpartum, relația dintre active scăzute
a enzimei laptelui cu „dezertare” locurilor de molibden - ocuparea este de 9, respectiv 18% din posibilul teoretic. Rolul enzimei în asigurarea imunității înnăscute este susținut de experimente efectuate pe șoareci eliminați pentru gena xantin-oxidoreductazei. Animalele homozigote (-/-) au murit în primele 6 săptămâni după naștere; heterozigoții (+/-) au supraviețuit, au avut fertilitate normală și au dat naștere la șoareci cu drepturi depline, care, totuși, au murit de foame din cauza tulburărilor de lactație ale părinților.

Aparent, xantinoxidaza este implicată în apărarea organismului în timpul infecțiilor virale. Astfel, la șoarecii infectați cu virusul gripal s-a observat o creștere semnificativă (de sute de ori) a activității xantinoxidazei în plămâni. Producția de 02 și H2O2 poate fi atât de puternică încât poate provoca patologie, în urma căreia animalele mor din cauza pneumoniei la 12 zile după infecție, în timp ce titrurile virusului în plămâni nu sunt determinate deja în a 10-a zi. Administrarea de adenozină (un precursor al xantinei) a redus, iar alopurinolul și SOD au crescut, supraviețuirea animalelor. Rezultate similare au fost obținute atunci când șoarecii au fost infectați cu citomegalovirus. Unul dintre inductorii formării O2 în timpul infecțiilor virale este α-interferonul, care stimulează transcripția xantin dehidrogenazei, care trece ulterior în forma oxidază. Totodată, trebuie amintit că xantin oxidoreductaza este singura sursă metabolică de acid uric, un antioxidant important în lichidele extracelulare (vezi capitolul 3), iar o creștere a activității sale în condiții patologice poate juca un dublu rol. Astfel, o creștere de peste 20 de ori a conținutului de enzime din creierul pacienților cu meningită bacteriană a permis autorilor să sugereze că prezența și inductibilitatea xantin-oxidoreductazei endoteliale protejează endoteliul vascular de deteriorarea oxidativă în timpul inflamației.

S-a demonstrat că O2, format în reacția xantinoxidazei, inhibă Ca2+-ATPaza reticulului sarcoplasmatic al celulelor musculare netede vasculare, inhibând astfel transportul Ca2+, care este una dintre cauzele leziunilor vasculare în diferite situații patologice. În plus, O2 servește ca precursor pentru alte forme de ACM, în special H2O2 și OH*, care au un efect citotoxic mai pronunțat. Prin urmare, interesul cercetătorilor pentru dezvoltarea inhibitorilor specifici ai xantinoxidazei este justificat; Alopurinolul sau metabolitul său cu viață lungă, oxipurinol, precum și aldehida pterina și acidul folic, sunt utilizate pe scară largă ca astfel de inhibitori.