Polarizaciona mikroskopija. Polarizirajući mikroskop. Hardver i oprema

Sadržaj teme "Metode izolacije bakterija. Mikroskopija. Hranljive podloge za uzgoj bakterija.":

Polarizaciona mikroskopija omogućava vam da dobijete slike neobojenih anizotropnih struktura (na primjer, kolagena vlakna, miofibrile ili mikrobne ćelije). Princip metode zasniva se na proučavanju objekta u svjetlosti koju čine dva zraka polarizirana u međusobno okomitim ravninama.

Rice. 11-4. Dijagram fluorescentnog mikroskopa.

Interferencijalna mikroskopija

Interferencijalna mikroskopija kombinuje principe fazno-kontrastne i polarizacione mikroskopije. Metoda se koristi za dobivanje kontrastne trodimenzionalne slike neobojenih objekata. Princip metode se zasniva na cijepanju svjetlosnog toka u mikroskopu; jedna zraka prolazi kroz objekat, druga - pored njega. Oba snopa su povezana na okularu i interferiraju jedan s drugim.

Rice. 11-5. Direktna imunofluorescencija. Direktna metoda uključuje upotrebu AT označenog fluorescentnom bojom na Ag od interesa; AT stupa u interakciju s Ag na mjestima njihove lokalizacije, što omogućava vizualizaciju oznake.

Fluorescentna mikroskopija

Metoda fluorescentne mikroskopije zasnovano na sposobnosti nekih supstanci da sijaju kada su izložene kratkotalasnom zračenju. U ovom slučaju, emitovani svetlosni talasi su duži od talasa koji izaziva sjaj. Drugim rečima, fluorescentni objekti apsorbuju svetlost jedne talasne dužine i emituju svetlost u drugom delu spektra (slika 11-4). Na primjer, ako je induktivno zračenje plavo, onda rezultirajući sjaj može biti crven ili žut. Ove supstance (fluorescein izocijanat, akridin narandža, rodamin, itd.) koriste se kao fluorescentne boje za posmatranje fluorescentnih (luminiscentnih) objekata. U fluorescentnom mikroskopu, svjetlost iz izvora (živine lampe ultra visokog pritiska) prolazi kroz dva filtera.

Rice. 11-6. Indirektna imunofluorescencija. Indirektna metoda uključuje korištenje dva različita AT-a. Prvi AT reaguju sa Ag mikroorganizama, drugi AT (povezani sa oznakom) specifično interaguju sa prvim AT, koji su Ag za drugi AT. Metoda je mnogo osjetljivija od direktne imunofluorescencije, jer se nekoliko molekula drugog AT vezuje za svaki molekul prvog AT.

Prvi (plavi) filter hvata svjetlost ispred uzorka i prenosi svjetlost talasne dužine koja pobuđuje fluorescenciju uzorka. Druga (žuta) blokira plavo svjetlo, ali prenosi žutu, crvenu, zelenu svjetlost koju emituje fluorescentni objekt i koju opaža oko. Obično se mikroorganizmi koji se proučavaju boje direktno ili pomoću AT ili lektina označenih fluorohromima. Lijekovi stupaju u interakciju sa Ag ili drugim ligand-vezujućim strukturama objekta. Fluorescentna mikroskopija je našla široku primenu za vizuelizaciju rezultata imunohemijskih reakcija na osnovu specifične interakcije AT obeleženog fluorescentnim bojama sa Ag proučavanog objekta. Opcije imunofluorescentne reakcije predstavljeni su na sl. 11-5 i 11-6.

pojmovnik:

Polarizovana svetlost je svetlosni talas čije se vibracije šire u jednom pravcu.

Svjetlosni val je električno i magnetsko zračenje čija je ravnina oscilovanja okomita na ravan prostiranja vala.
Polarizator (Nicole I) je uređaj koji prenosi samo potpuno ili djelomično polariziranu svjetlost. Dizajniran da prenese polarizovanu svetlost na (kroz) prozirni objekat koji se proučava i odseče (rasprši) nepolarizovano svetlo (prirodno svetlo, veštačko svetlo, uključujući zračenje iluminatora mikroskopa). Intenzitet svjetlosti koja prolazi kroz polarizator opada proporcionalno kvadratu kosinusa ugla između ravni polarizacije polarizatora i analizatora (Malusov zakon):

Gdje je: I je intenzitet prije prolaska kroz polarizator, I je intenzitet svjetlosti nakon prolaska kroz polarizator, φ je ugao između ravnina polarizacije polarizirane svjetlosti i polarizatora.

Analizator (Nicol II) - uređaj sličan polarizatoru, ali dizajniran za analizu polarizirane svjetlosti.

Zarotirajte analizator u odnosu na polarizator za ugao ϕ. Intenzitet svjetla je označen crvenom strelicom.

Kompenzator je uređaj za određivanje kvantitativnih karakteristika polarizacije. Konvertuje kontrastnu vidljivu sliku u sliku u boji, jer potiskuje određene talasne dužine u beloj svetlosti.
Linearno polarizirana svjetlost je svjetlost čija je ravnina vibracije ograničena u jednom smjeru i koja se širi u jednoj ravni.
Faza oscilacija svjetlosnog vala, sa matematičke tačke gledišta, je argument svjetlosne valne funkcije, odnosno ωt+φ 0 u funkciji sin(ωt+φ 0). Sa fizičke tačke gledišta, ovo je određeno elektromagnetno stanje u određenom trenutku.

Talasna dužina je udaljenost između dvije najbliže tačke koje su u istoj fazi.

Refleksija je promjena smjera vala. Potpuna refleksija je promjena ugla prelamanja talasa manja od 90°.

Refrakcija je promjena smjera vala na granici dva medija. Dvolomnost je cijepanje jednog zraka svjetlosti u anizotropnom mediju na dva zraka.

Slika 4 – Refrakcija zraka u kristalu islandskog šparta.

Dikroizam je djelomična apsorpcija svjetlosti supstancom, ovisno o njenoj polarizaciji.

Interferencija je promjena intenziteta svjetlosti kada se dva ili više svjetlosnih talasa preklapaju.

Razlika putanje svjetlosnih zraka je vrijednost koja karakterizira usporavanje brzine svjetlosti pri prolasku kroz prozirnu tvar. Razlika putanje se mjeri udaljenosti koju svjetlost pređe u vakuumu za isto vrijeme koje je potrebno da pređe kroz supstancu koja se proučava, u tačkama prostora koji se proučava.

Konoskopija je metoda za proučavanje optičkih svojstava anizotropnih objekata u konvergentnim snopovima polarizirane svjetlosti. Tokom konoskopije, vrše se zapažanja promjena u obrascu interferencije kada se analizator rotira. Rotirajući analizator i polarizator jedan u odnosu na drugi, istraživač kroz mikroskop posmatra konoskopske figure koje se sastoje od izogira (to su tamne pruge koje odgovaraju smjeru oscilacija svjetlosnih valova u polarizatoru) i izohroma (to su pruge različitih boja interferencije koji odgovaraju pravcima kretanja zraka u kristalu sa istom razlikom poteza).

Ortoskopija je metoda za proučavanje optičkih svojstava anizotropnih objekata u paralelnim snopovima polarizirane svjetlosti.

Pleohroizam je promjena u opaženoj boji nekih anizotropnih objekata kada se promijeni ugao posmatranja (promjena boje kristala kada se stol rotira).

Polarizacijski mikroskop je mikroskop dizajniran za proučavanje dvostrukog prelamanja polarizirane svjetlosti koja prolazi kroz anizotropni medij

Prvi polarizacijski mikroskop dizajnirao je 1863. Henry Clifton Sorby i razlikovao se od uobičajenog optičkog mikroskopa po dvije Nicol prizme postavljene na optičkoj stazi. Nicolas prizma propušta svjetlost kroz sebe samo u jednom smjeru iu jednoj ravni, odnosno ravninsko polariziranu svjetlost; ostatak svjetlosti koji ulazi u te prizme se potpuno odbija i raspršuje. Ove prizme se strukturno ne razlikuju jedna od druge i služe kao polarizatori (analizator i polarizator). Kada se ravan polarizacije analizatora zarotira za 90º u odnosu na ravan polarizacije polarizatora, istraživač posmatra polarizacioni obrazac dvolomnog objekta, a svi objekti koji nemaju dvolomnost su potamnjeni. U modernim mikroskopima, da bi se dobilo više informacija, mogu se koristiti DIC prizme (kombinacija reljefa sa uzorkom polarizacije, za proučavanje neobojenih uzoraka), kompenzatori (za kvantitativnu polarizaciju), okrugli sto (za proučavanje pleohroizma) i jednostavni polaroidi za jednostavna posmatranja (na primjer, u biologiji i medicini).

Najčešća primjena polarizacije je u kristalografskim mikroskopima, gdje se svojstva anizotropnih objekata mogu odrediti pomoću konoskopije i ortoskopije. Obratite pažnju na sličnosti i razlike između konoskopije i ortoskopije: svjetlosni snop prolazi kroz polarizator (1), ograničen je otvorom dijafragme (2), prolazi kroz kondenzatorska sočiva (3); analizator (koji istraživač okreće) (8) i kompenzatori (7).

Slika 1 – Šema polarizacionog mikroskopa za: a) Ortoskopiju b) Konoskopiju

Legenda: 1 - polarizator, 2,6 - dijafragma; 3 - kondenzator; 4 - droga; 5 - sočivo; 7 - kompenzator; 8 - analizator; 9 - Bertrand sočivo; 10 - fokusna ravan okulara; 11 - okular.

Posmatranu sliku čine konoskopske figure. konoskopske figure - sastoje se od izogira (to su tamne ravne ili zakrivljene pruge u kojima su smjerovi vibracije paralelni s glavnim dijelovima nikola) i izohroma (to su pruge obojene različitim interferentnim bojama. Svaka traka odgovara smjerovima zrake nastale tokom dvolomnosti i imaju istu razliku putanja).

Navedimo primjer: u pločama jednoosnog kristala rezanog okomito na optičku os, vidjet ćemo izogir u obliku križa i koncentrične izokromne prstenove, vidi sl. 5.

Slika 5 - A) Konoskopske figure jednoosnog minerala kalcita B) Biaksijalni mineral flogopit sa umetnutim kompenzatorom.

Na osnovu prirode rezultirajućeg interferentnog uzorka, mjere se veličina dvoloma, uglovi rotacije ravni polarizacije, uglovi ekstinkcije, određivanje broja optičkih osa i druge karakteristike. Sve ove karakteristike jasno pokazuju koji kristal istraživač posmatra i njegovu strukturu. Mikroskopi poput BX53P i H600P dizajnirani su za mineralogiju i kristalografiju. Opremljeni su najboljom optikom bez naprezanja i kompenzatorima proizvedenim na modernoj opremi, eliminišući zazore i praznine prilikom ugradnje u mikroskop.

Dvolomnost se koristi ne samo u kristalografiji, već iu medicini, biologiji, forenzici i metalografiji, jer je za istraživače važno da brzo i precizno izoluju vitamine, kiseline, minerale, naprezanja u izotropnim objektima, nemetalne inkluzije u originalnom uzorku, i drugi. Na primjer, mikroskopi za histologiju i citologiju opremljeni su polarizatorima za identifikaciju različitih vrsta objekata. Okrugli objekti prečnika oko 2,4 mikrona, lipoidi i kapi, sa ukrštenim polarizatorima formiraju malteški unakrsni interferentni obrazac. Nemaju sve supstance ista refrakciona svojstva na različitim temperaturama, na primer, možemo razlikovati 1) supstance koje dobijaju anizotropna svojstva hlađenjem i gube ih pri zagrevanju: holesterol i njegovi estri 2) koje ne gube svoja anizotropna svojstva pri zagrevanju: cerebrozidi , fosfatidi, mijelini. Ova varijabilnost svojstava je posljedica sposobnosti tvari da održi kristalnu strukturu, jer To je ono što uzrokuje dvolomnost. Posmatranjem anizotropnih objekata u polarizirajućem mikroskopu i određivanjem njihove koncentracije moguće je dijagnosticirati bolesti kao što su: artritis, ateroskleroza, lipoidurija, cilinurija i lipidoza po sjaju lipida sa ukrštenim polarizatorima, kao i giht, urolitijaza, selikoza i azbest. kristalima uree, silicijum dioksida i azbestnim vlaknima. Za histologiju i citologiju razvijen je mikroskop BX46, koji je opremljen niskim stolom, snažnim iluminatorom i cijevi podesivom po visini koja će osloboditi leđa istraživača od utrnulosti.

U polariziranoj svjetlosti škrob, celuloza, neke kiseline i vitamin C imaju drugačiju boju od izotropnih objekata, tako da i mikroskopi za farmakologiju i farmaciju moraju biti opremljeni polarizatorima. Farmakološki mikroskop uključuje modele CX43, BX43 i druge, jer je svake godine sve više istraživanja u ovoj oblasti, a novi istraživački objekti zahtijevaju drugačiji pristup.

U forenzičkoj nauci važno je razlikovati inkluzije kvarcnih zrnaca i drugih minerala od organskih i drugih materijala koji se mogu naći na mjestu zločina, tako da mikroskop mora biti opremljen reflektiranom svjetlošću kako bi se pregledali neprozirni objekti. Mikroskop BX53M je pogodan za forenzičku nauku, jer je opremljen ne samo snažnim izvorom prenošene svjetlosti, već i jednako moćnim iluminatorom reflektirane svjetlosti, a umetci za povećanje radne udaljenosti mikroskopa omogućit će vam da proučavate vrlo velikih objekata bez opsežne preliminarne pripreme.

Polarizacijski mikroskopi se također koriste u metalografiji, ali za takve studije dovoljno je znati prisutnost ili odsustvo anizotropnih objekata, kao i njihovu prostornu distribuciju. Upravo za klasifikaciju i brojanje takvih objekata u metalografiji se mogu koristiti mikroskopi VHX6000, BX53P sa instaliranim Stream-om.

Polarizaciona mikroskopija je jedna od moćnih metoda za morfološko proučavanje strukture i svojstava lijekova. Polarizaciona mikroskopija omogućava proučavanje svojstava histoloških struktura koje su dvolomne.

Za implementaciju metode polarizacijske mikroskopije, svaki mikroskop se može naknadno ugraditi. Mikroskop je opremljen sa dva polarizujuća filtera: prvi je postavljen direktno ispod kondenzatora, drugi je postavljen između sočiva i oka istraživača. Okretanjem polarizatora vidno polje je zatamnjeno. Lijek je postavljen. Rotirajte preparat na pozornici dok se ne pojave blistave strukture. Sjaj se pojavljuje u trenutku kada je osa dvolomnog objekta pod uglom od 45° u odnosu na ravan polarizacije.

Ranije su se za polarizacionu mikroskopiju koristili polarizacioni filteri sa linearnom polarizacijom. Nova tehnika je ispitala mogućnost dijagnosticiranja lijekova korištenjem polarizacijskih filtera s kružnom polarizacijom. Pokazalo se da slike dobijene pomoću kružnih filtera nose mnogo više informacija i omogućavaju identifikaciju finije strukture tkiva i ćelija.

Studije polariziranog svjetla mogu se izvoditi na smrznutim ili parafinskim rezovima nakon deparafinizacije, neobojenim i obojenim, ugrađenim u različite medije. Blokove tkiva treba rezati i usmjeriti tako da se mišićna vlakna interesnog sloja miokarda preseku uzdužno.

Miofibrile u polariziranom svjetlu pokazuju karakteristične poprečne pruge povezane s izmjenom anizotropnih (A) i izotropnih I - diskova. A diskovi imaju izražen pozitivan dvolom i izgledaju svijetli u polariziranom svjetlu (tamni su na običnom svjetlu), dok su I diskovi gotovo potpuno lišeni dvolomnosti i izgledaju tamni u polariziranom svjetlu (u običnom svjetlu su svijetli).

Koristeći polarizacionu mikroskopiju, prikladno je identificirati najuniverzalnije oštećenje mišićnih vlakana miokarda i skeletnih mišića - oštećenje kontrakture (poremećena poprečna prugastost kardiomiocita jedan je od ranih znakova oštećenja miofibrila).

Uobičajeno je razlikovati 3 faze ovih oštećenja:

Faza I - povećava se anizotropija u određenim područjima mišićnih vlakana. II

faza - A-diskovi sa povećanom anizotropijom se približavaju, zbog čega se smanjuje debljina 1-diskova. III

faza - A-diskovi se spajaju u kontinuirani anizotropni konglomerat.

Uz povrede kontrakture, polarizujuća mikroskopija

omogućava nam da identificiramo još jednu vrstu oštećenja prugastih mišićnih vlakana - hiperrelaksaciju sarkomera, koja je u velikoj mjeri karakteristična za ishemiju miokarda.

Jednostavnost metode polarizacije omogućava, uz minimalne troškove, dramatično povećanje pouzdanosti dijagnosticiranja prisustva infarkta miokarda.

Što se tiče polarizacionog mikroskopa. Situacija je da se skoro svaki mikroskop može pretvoriti u polarizacijski. Koriste se dva polarizaciona filtera (kupuju se u foto prodavnici) - jedan se postavlja iznad osvetljivača, a drugi između preparata i sočiva.

Napravljen je referentni CD-ROM - “Polarizaciona mikroskopija”. Disk sadrži veliki broj radova i materijala o upotrebi polarizacione mikroskopije.

Osim toga, stvoren je i specijalizovani kompleks - automatizirana forenzička radna stanica. Kompleks uključuje polarizirajući mikroskop Nikon E200, digitalni fotoaparat sa 8 miliona elemenata, adaptere i softver.

Reference: 1.

Kaktursky L.V. Polarizaciona mikroskopija. U knjizi. Mikroskopska tehnika. - M.: Medicina, 1996. 2.

Cellarius Yu.G., Semenova L.A. Primjena polarizacijske mikroskopije za histološku dijagnozu ranih faza ishemijskog i metaboličkog oštećenja miokarda // Cor et vasa. - 1977 - Vol. 19. - br. 1. - str. 28-33 3.

Nepomnyashchikh L.M. Morfogeneza najvažnijih opštih patoloških procesa u srcu. - Novosibirsk: Nauka, 1991. - 352 str. 4.

Cellarius Yu.G., Semenova L.A., Nepomnyashchikh L.M. Fokalne povrede i infarkt miokarda. Svetlosna, polarizaciona i elektronska mikroskopija. - Novosibirsk, 1980.

Više o temi Koltova N.A. NOVA METODA POLARIZACIONE MIKROSKOPIJE ZA DIJAGNOSTIKU INFARKTA MIOKARDA:

PITANJE 252: Koji nedostaci u profesionalnom radu medicinskih radnika mogu postati razlog za pokretanje krivičnog ili građanskog postupka?
Kirilov V.A., Bakhmetyev V.I. UPOTREBA MORFOMETRIJSKE METODE ZA DIJAGNOSTIKU VRSTE VANJSKOG UTJECAJA PO MORFOLOŠKIM ZNAKIMA DESTRUKCIJE DUGIH CEVASTIH KOSTIJU
Mišin E.S., Podporinova E.E., Pravodelova A.O. EVALUACIJA METODA ZA DIJAGNOSTIKU OŠTEĆENJA HIPOGLUSNE KOSTI, LARINKSA I DUŠNIKA KOD TUPOG VRATA

Recimo da imate par razbijenih polarizacionih naočara (polarizatora). Ako uzmete jednu čašu i okrenete je u odnosu na drugu, dobijate mrak. Stepen neprozirnosti ovisi o kvaliteti polarizatora.

Suzbijanje 95-98% svjetlosti je odlično; ako je mnogo manji, pojavljuje se prljavo siva nijansa.Relativni položaj polarizatora pri dobijanju tamnog polja naziva se ukrštenim, pri dobijanju najsvetlije nule - paralelnim.

Prije nego što pređemo na polarizacijsku mikroskopiju, vratimo se gore spomenutom patologu.

Dodajmo uređaj njegovom svijetlom polju ili fazno-kontrastnom mikroskopu između binokularnog nastavka i tijela mikroskopa koji će omogućiti uvođenje polarizacijskog elementa (analizator) u optički put. Stavimo drugi polarizacioni element (polarizator) ispod kondenzatora i okrećemo ga dok se ne dobije potpuni mrak (analizator i polarizator se ukrste); Hajde da popravimo njihovu poziciju. Ubacimo u ovaj uređaj (između nastavka za dvogled i tijela mikroskopa) uvlačivi držač sa kompenzatorom - crvenu ploču prvog reda. Recimo da patolog pregleda uzorak tkiva i primijeti predmet koji izgleda kao kristal. On postavlja analizator, okreće polarizator u ukršteni položaj i ispituje objekat. Ako se radi o kristalnoj ili kristalnoj formaciji, onda svijetli kao da je svjetlo uključeno iza prozirnog ekrana. Patolog još ne može utvrditi radi li se o kristalu mokraćne kiseline ili kalcija. On uvodi crvenu ploču prvog reda u tok zraka i okreće je iz jednog postavljenog položaja u drugi: kristal postaje ili crven ili zelen. Na taj način se može odrediti priroda kristala. Zatim patolog uklanja analizator i, po želji, polarizator s optičke staze i nastavlja s radom (proučavano područje uzorka ostaje u vidnom polju).

Skrenimo sada našu pažnju na polarizacijski mikroskop. Uključuje mnoge komponente koje su prisutne u konvencionalnom mikroskopu svijetlog polja, budući da uključuje ispitivanje uzorka u svijetlom polju između polarizacijskih elemenata.

Vrlo često, posebno u podučavanju studenata, koriste se monokularni polarizacijski mikroskopi zbog njihove niske cijene. Profesori preferiraju dvoglede. Binokularna glava može biti opremljena fiksnim ili fokusirajućim Bertrand sočivom, neophodnim za istraživanje

(njegove funkcije su opisane u nastavku). Između mlaznice i tijela nalazi se dio u kojem se nalazi analizator, te utor za ugradnju kompenzatora.

Mikroskop ima okrugli i rotirajući stepen, koji vam omogućava da pregledate uzorak rotirajući ga između ukrštenog analizatora i polarizatora. Stol je opremljen i skalom za mjerenje njegove rotacije u stepenima i lučnim minutama. Ispod stepena objekta (obično ispod kondenzatora) nalazi se rotirajući polarizator čija je pozicija fiksirana na 0, 45° i 90° u odnosu na poziciju analizatora. Naravno, mikroskop je opremljen otvorom dijafragme i, po pravilu, držačem filtera.

Okular mono- ili binokularnog nastavka ima ukrštenicu. Svo centriranje se vrši u odnosu na ovaj križić, priprema se također rotira oko centra ovog križa.

Razlika između mehaničkog stupnja je u tome što mora biti niska kako ga sočiva ne bi udarila pri okretanju. Vrlo često se radi o mjernom stolu, koji se, kada se pomiče u smjeru istok-zapad ili sjever-jug, uzastopno fiksira u određenim intervalima. Zamislite loptu koja pada u žljeb - tako funkcionira mehanizam za fiksiranje. Možete uzeti predmet oštriji od lopte - efekat će biti isti. Dok rotirate sočiva, mehanizam za zaključavanje drži svako sočivo na optičkoj putanji zraka.

Za brojanje različitih komponenti na tankom krišku, dodijeljeni su im brojevi na brojaču od 1 do 9. Broj 10 je za emisije ili zbrajanje. Istraživač pomiče preparat dok se stol ne učvrsti i gleda da li je jedna od 9 komponenti na nišanu. Ako nijedna od njih nema, izaberite broj 10. Prilikom brojanja materijala na tezgi potrebno je navesti broj svake komponente i sve ostalo na broju 10. Nakon pregleda cjelokupnog preparata, možete izračunati postotak bilo koju od 9 komponenti materijala.

Kompenzator je ugrađen u mikroskop pod uglom od 45° u pravcu sjever-jug i istok-zapad.

Većina komponenti je vidljiva isto bez obzira na to kako su pozicionirane u odnosu na kompenzator, ali neke zahtijevaju rotaciju, što je još jedan razlog zašto bina mora biti rotirajuća. Nećemo ulaziti u detalje o funkcijama raznih dilatacijskih spojeva ili klinova, jer možete kupiti posebnu knjigu na ovu temu. Navešćemo samo neka imena: ploča talasne dužine 1/4 - kvarcni klin, koji može imati 6, 30 ili 120 redova; crvena ploča prvog reda (ima još tri imena koja označavaju starost onih koji ih koriste: ploča za sporo svjetlo, ploča osjetljivog tona i ploča od gipsa, najstarija).

Razmotrimo koncept „reda“. Kada se svjetlost prelama kroz prizmu, sve boje spektra postaju vidljive, zatim postaju blijeđe (treći, četvrti itd. skupovi boja). Nulti red je crno svjetlo na samom početku spektra. Crvena ploča prvog reda, kao što ime govori, ekvivalentna je crvenoj u prvom redu boja.

Bertrand sočivo u kombinaciji sa okularom pruža pomoćnu nišansku cijev, koja omogućava da se vide interferencijske figure u izlaznoj zjenici mikrosočiva dok je sam mikroskop fokusiran na određeno zrno uzorka. Ako geolog treba da identifikuje materijal, on rotira tanak deo minerala između ukrštenog polarizatora i analizatora. U ovom slučaju su vidljive 2 boje (i samo 2), a za transformaciju jedne boje u drugu potreban je određeni kut rotacije preparata. Većina minerala se može identifikovati na ovaj način. Međutim, neki minerali su toliko slični po boji i uglovima rotacije da su interferentni obrasci jedini način da se identifikuju.

Petrografija proučava geologiju nafte. Petrografski mikroskop nema Bertrand sočivo jer njegovim korisnicima nije potreban uzorak interferencije.

Standardni geološki radovi se izvode na tankim profilima. Sastoji se od tankog presjeka kamena, brušenog, montiranog u epoksidnu smolu na staklo 1x2 inča, a zatim ponovno brušenog tako da debljina presjeka ne prelazi 15 mikrona; Nakon toga preparat se postavlja na binu i pokriva pokrovnim stakalcem. Takvi preparati se posmatraju na svetlosti koja dolazi iz polarizatora kroz tanak presek.

Sve takve studije odnose se na mikroskop svijetlog polja, kojem se dodaju polarizator, analizator i kompenzator.

Istraživač rude može započeti s pripremom uzorka na isti način kao i tanki rez tako što će ga napraviti debljine 6-10 mm i izbrusiti površinu. To će zahtijevati epi-osvjetljenje, stoga se iluminator mora postaviti između glave binokula i tijela mikroskopa. Biće i sijalica i transformator; polarizator, analizator, kompenzator; otvor blende i dijafragme polja, dikroično ogledalo, itd. d.

Polarizirana svjetlosna sočiva rade drugačije od standardnih sočiva. Glavna stvar je da oni moraju biti oslobođeni unutrašnje napetosti. Napetost u sočivima nastaje kao rezultat pritiska metalnih okvira na rubove sočiva. Kada se posmatra kroz mikroskop, ovo se čini kao bljesak bijele svjetlosti koji dolazi od tačke pritiska prema centru.

Proizvođači pažljivo provjeravaju sočiva na unutrašnju napetost. Ona sočiva koja nemaju napetost se isporučuju sa polarizacionim mikroskopima po visokoj ceni; a sočiva sa zatezanjem su uključena u biološke mikroskope, u kojima napetost ne igra nikakvu ulogu, ili su potpuno odbačena.

Pokazali smo vam potrebu za našim objektivima. Ovi objektivi su dizajnirani i prilagođeni za rad sa uzorcima ispod pokrovnih stakala debljine 0,17 mm.

Prilikom ispitivanja rude pod mikroskopom, polirana površina nije prekrivena pokrovnim stakalcem. Za takav rad potrebna su nam sočiva koja se neće podešavati u odnosu na pokrivne navlake, ili sočiva za metalografiju, ali bez zatezanja.

10x objektivi se mogu koristiti sa ili bez pokrovnih stakala. Rudni mikroskopi će zahtijevati 20x ili više objektiva koji se ispravljaju zbog odsustva pokrovnog stakala.

Naš standardni polarizacijski mikroskop obično dolazi s objektivima 5x, 10x i 40x. Revolver ima 4 otvora za sočiva, tako da smo dodali drugo 40x sočivo za dijapozitive bez pokrovnog stakala, stvarajući tako dvostruki svjetlosni polarizacijski mikroskop. Ranije, pri opisu Huygens okulara, u napomeni, rečeno je da oni ne pružaju korekciju boje ili kompenzaciju hromatskih aberacija i da biste riješili ovaj problem trebali biste pogledati odjeljak “Polarizacijska mikroskopija”.

Nakon što smo se odlučili za značenje boja, ne želimo da okular ili sočivo proizvode boje u vidnom polju koje ne pripadaju preparatu. Znamo da su sočiva bez napetosti odabrana za polarizacione mikroskope zbog nedostatka napetosti i korekcije boje. Stoga je veoma važno da okulari budu i bez korekcije ili kompenzacije boje. Iz tog razloga, polarizacijski okulari se obično modificiraju u Huygens okulare. Ponekad se koriste i okulari širokog polja, ali posebno testirani na usklađenost s polarizacijskim mikroskopom.

Budite oprezni kada izračunavate ukupno povećanje polarizacionog mikroskopa. Zbog visine uređaja koji se koristi za montažu analizatora i kompenzatora dolazi do dodatnog povećanja priključka za dvogled. Na primjer, mikroskop opremljen revolverom za 3 sočiva ima dodatno povećanje od 1,4x, a mikroskop sa revolverom za 4 sočiva ima dodatno povećanje od 1,8x.

Na sl. Slika 10 prikazuje opšti prikaz polarizacionog mikroskopa.

1. Okular širokog polja 10x sa dugim reljefom oka

2. Bertrand sočivo

3. Utor za kompenzator

4. Mikro sočiva bez napetosti

5. Rotirajuća pozornica sa skalom na brojčaniku; cijena podjele 1°

6. Kondenzator

7. Rotirajući polarizator sa mogućnošću uklanjanja zraka sa putanje

8. Field iris dijafragma

9. Fokusirajući 10x okular sa vodičem i ukrštanjem

10. Binokularna glava sa rotacijom od 360° i uglom nagiba od 30° prema optičkoj osi

11. Vijak za pričvršćivanje binokulara

12. Držač analizatora

13. Revolver sa mikro sočivima

14. Stalak za mikroskop

15. Držači za drogu

16. Regulator za pomeranje visine nosača kondenzatora

17. Koaksijalno locirani mehanizmi grubog i finog fokusiranja

18. Baza mikroskopa sa ugrađenim transformatorom i podešavanjem osvetljenja 6 V, 30 W halogene lampe.

Polarizaciona mikroskopija- jedna od veoma efikasnih metoda morfološkog istraživanja, koja ima široke mogućnosti za identifikaciju bioloških struktura, što u kombinaciji sa dostupnošću i relativnom jednostavnošću određuje njegovu visoku vrednost. Metoda omogućava proučavanje ne samo histološke strukture lijeka, već i nekih njegovih histokemijskih parametara. 40-ih i 50-ih godina XX vijeka. polarizaciona mikroskopija se smatrala ultrastrukturnom metodom, jer je omogućila uvid u ultrastrukturne sposobnosti tkiva.

Polarizaciona mikroskopija je dizajnirana za proučavanje svojstava histoloških struktura koje imaju sposobnost dvostrukog prelamanja (anizotropije) - cijepanja svjetlosnog snopa pri prolasku kroz anizotropni medij. Svjetlosni val u anizotropnom mediju raspada se na dva talasa sa međusobno okomitim ravnima oscilovanja elektromagnetnih talasa. Ove ravni se nazivaju ravnima polarizacije. Polarizovana svetlost se razlikuje od obične (nepolarizovane) svetlosti po tome što kod potonje svetlosni talasi osciluju u različitim ravnima, dok se u polarizovanoj svetlosti javljaju samo u određenoj ravni.

Za stvaranje efekta polarizacije, polarizacijski mikroskop koristi dva polaroida. Prvi, koji se naziva polarizator, nalazi se između iluminatora mikroskopa i histološkog uzorka, a drugi polaroid, koji se nalazi između histološkog uzorka i oka istraživača, je analizator. I polarizator i analizator su optički potpuno isti polarizacijski filteri, tako da se mogu zamijeniti (ako dizajn mikroskopa to dozvoljava). Ranije su se za polarizacionu mikroskopiju koristile Nicolas, Arens ili Thomsonove prizme napravljene od islandskog šparta. Ove prizme su imale ograničen ugao prelamanja svetlosti. Trenutno se umjesto njih koriste ravni polarizacijski filteri koji proizvode polariziranu svjetlost širokog polja.

U stvaranju polarizirane svjetlosti, odlučujuću ulogu ima relativni položaj polarizatora i analizatora u odnosu na optičku os mikroskopa. Ako su orijentisani tako da oba prenose polarizovanu svetlost u istoj ravni, tj. kada se njihove ravni polarizacije poklapaju, oba polarizujuća filtera su sposobna da prenose polarizovanu svetlost; vidno polje mikroskopa je svetlo (slika 1a).

Rice. 1 Brightfield uzorak ljudskog pluća, OlympusCX41, 10x sočivo

Ako su ravni polarizacije polarizacijskih filtara međusobno okomite (to se postiže rotacijom analizatora za 90° oko optičke ose mikroskopa), tada polarizirana svjetlost ne prolazi i istraživač vidi tamno vidno polje (sl. 2).

Kada se polarizator okrene za 360° dok se okreće, vidno polje je dva puta potpuno zatamnjeno i dvaput potpuno svjetlije. U prošlosti su se koristili kompenzacijski Bernauer filteri, koji proizvode crvenkastu nijansu tamnog vidnog polja ( U-TP530 ). Kada se koriste crni zrcalni filteri, zatamnjeno vidno polje ne izgleda potpuno tamno, već slabo osvijetljeno.

Slika 2 Uzorak ljudskih pluća u polarizovanom svetlu, 10x objektiv

U slučajevima kada se kod ukrštenog položaja polarizacionih filtera (tj. u ortoskopiji) na putu polarizovane svetlosti nađu anizotropne supstance sadržane u histološkom uzorku, te supstance dele polarizovanu svetlost na dva snopa sa međusobno okomitim ravnima oscilovanja svetlosti. talasi. Svjetlosni zraci čija se ravnina vibracije poklapa s ravninom polarizacije prolaze kroz analizator, a one s ravninom okomitom se odsječu, zbog čega je intenzitet svjetlosnog toka koji ulazi u oko istraživača i na kameru je samo polovina. intenzitet originalnog svetlosnog snopa. Kao rezultat opisanih procesa, anizotropne tvari smještene između dva ukrštena polarizatora vidljive su na tamnoj pozadini u obliku svijetlih svjetlećih objekata. Istovremeno, izotropne strukture koje nemaju sposobnost dvostrukog prelamanja ostaju tamne.

Ovo takođe utiče na izbor kamere za polarizacionu mikroskopiju. Budući da je zadatak uhvatiti male svijetle signale na tamnoj pozadini, obično kamera za mikroskopiju svijetlog polja možda neće biti dovoljna zbog niske osjetljivosti kamere i velike količine šuma koja se stvara tokom snimanja. Za polarizacionu mikroskopiju Potrebna je mikroskopska kamera sa visokom osjetljivošću i preciznom reprodukcijom boja. Poželjno je koristiti kamere zasnovane na CCD matricama (, VZ-CC50S), međutim, u trenutnoj fazi, možete koristiti i budžetske verzije kamera zasnovanih na CMOS matricama Sony IMX serije ().

Biološka tkiva sadrže dovoljan broj anizotropnih struktura: elemente kontraktilnog aparata mišića, amiloid, mokraćnu kiselinu, kolagenske formacije, neke lipide, određeni broj kristala itd.

Svjetlosne zrake koje se cijepaju u anizotropnom objektu i prolaze kroz analizator karakteriziraju nejednake brzine širenja valova. U zavisnosti od veličine ove razlike (također se naziva vrijednost kašnjenja svjetlosnog snopa) i zbog razlika u apsorpciji svjetlosti u analizatoru, sjaj anizotropnih objekata može biti bijeli ili obojen. U potonjem slučaju govorimo o fenomenu dihroizma ( dvostruka apsorpcija I). Kada se proučavaju u polariziranom polju, efekti boja proizvode se, na primjer, od strane mnogih kristala.

Proces dvostrukog prelamanja može se poboljšati upotrebom određenih boja, čiji molekuli imaju sposobnost da se orijentirano talože na anizotropne strukture. Histohemijske reakcije koje rezultiraju efektom anizotropije nazivaju se topo-optičke reakcije (G. Romhanyi). Postoje dvije vrste takvih reakcija - aditivna i inverzna. Kod aditivnih reakcija povećava se kašnjenje svjetlosnog snopa, što se naziva pozitivna anizotropija, a kod inverznih reakcija se smanjuje - negativna anizotropija.

HARDVER I OPREMA

Polarizaciona mikroskopija se izvodi pomoću posebnih polarizacionih mikroskopa. Kao primjer možemo navesti uvozne mikroskope. Većina modernih optičkih mikroskopa opremljena je priborom za polarizacionu mikroskopiju.

Bilo koji laboratorijski ili istraživački svjetlosni mikroskop može se koristiti za polarizacionu mikroskopiju. Dovoljno je imati dva polarizirajuća filtera, od kojih je jedan, kao polarizator, postavljen između izvora svjetlosti i uzorka, a drugi, koji ima ulogu analizatora, postavljen između uzorka i oka istraživača. Polarizator se može ugraditi u kondenzator ili postaviti ispod njega iznad dijafragme polja, a analizator se može postaviti u prorez na revolveru ili u međuuložak.

Na sl. Slika 3 prikazuje šematski dijagram polarizacionog mikroskopa. Pored komponenti zajedničkih za sve svjetlosne mikroskope, polarizacijski mikroskop ima dva polarizirajuća filtera (polarizator koji se obično nalazi ispod kondenzatora i analizator smješten u okularu), kao i kompenzator. Analizator se mora rotirati, a za određivanje stepena rotacije potrebna je odgovarajuća graduirana skala.

Polarizacijski mikroskop koristi izvor osvjetljenja koji pruža veliku gustinu svjetlosnog snopa. Kao takav izvor preporučuje se upotreba lampe od 100 W na naponu od 12 V. Za neke vrste istraživanja potrebno je monohromatsko svjetlo. U tu svrhu koristi se metalni filter za smetnje, koji je najbolje postaviti iznad ogledala. Matirano staklo koje raspršuje svjetlost se postavlja ispred polarizatora, tj. između njega i izvora svjetlosti, ali ni u kom slučaju nakon polarizatora, jer će to poremetiti funkciju polarizacijskog filtera.

U prošlosti su se za polarizacionu mikroskopiju koristili akromatski objektivi bez unutrašnje napetosti, ali su danas rijetki. Danas se u polarizirajućim mikroskopima koriste samo planski akromatski objektivi koji nemaju unutrašnje napetosti. Apohromatska sočiva se mogu koristiti samo u slučajevima kada je potreban normalan prikaz boja tokom mikrofotografije.

Polarizacijski mikroskopi su opremljeni rotirajućim stupnjem, čiji se položaj u odnosu na optičku os može mijenjati. Ugao rotacije stola se mjeri pomoću stepena skale označene duž njegovog obima. Jedan od preduslova za efikasnu upotrebu polarizacione mikroskopije je pažljivo poravnavanje rotirajućeg stepena pomoću šrafova za centriranje.

Važan element polarizacionog mikroskopa je kompenzator postavljen između objektiva i analizatora, obično u cijevi mikroskopa. Kompenzator je ploča izrađena od posebnih vrsta gipsa, kvarca ili liskuna. Omogućava vam da izmjerite razliku u putanji podijeljenih svjetlosnih zraka, izraženu u nanometrima. Funkcioniranje kompenzatora osigurava se njegovom sposobnošću da promijeni razliku u putanji svjetlosnih zraka, smanjivši je na nulu ili povećavši je do maksimuma. To se postiže rotacijom kompenzatora oko optičke ose.

MIKROSKOPSKA TEHNIKA U POLARIZOVANOM SVETLU

Prikladnije je provoditi polarizacijsku mikroskopiju u zamračenoj prostoriji, jer je intenzitet svjetlosnog toka koji ulazi u oko istraživača smanjen za 2 puta u odnosu na originalni. Nakon uključivanja iluminatora mikroskopa, prvo ostvarite najsjajnije moguće osvjetljenje vidnog polja rotacijom polarizatora ili analizatora. Ova pozicija polarizacionih filtera odgovara podudarnosti njihovih ravni polarizacije. Lijek se postavlja na pozornicu i prvo proučava u svijetlom polju. Zatim se rotacijom polarizatora (ili analizatora) vidno polje zatamni što je više moguće; ovaj položaj filtera odgovara okomitom rasporedu ravni polarizacije. Da bi se otkrio efekat anizotropije, potrebno je kombinovati ravan polarizacije anizotropnog objekta sa ravninom polarizovane svetlosti. Empirijski, ovo se postiže rotiranjem stepena objekta oko optičke ose. Ako se za polarizacionu mikroskopiju koristi svjetlosni mikroskop koji nije opremljen rotirajućim stupnjem, tada se histološki uzorak mora ručno rotirati. Ovo je prihvatljivo, ali je u ovom slučaju nemoguće izvršiti određene vrste polarizacione mikroskopije koje zahtijevaju kvantitativnu procjenu (određivanje predznaka dvoloma, veličine razlike u putanji svjetlosnih zraka).

Ako su anizotropni objekti u uzorku raspoređeni na uredan način (na primjer, anizotropni diskovi prugastih mišićnih vlakana), zgodno ih je proučavati u fiksnoj poziciji pozornice, u kojoj ti objekti daju maksimalnu luminescenciju na tamnoj pozadini. . Ako se anizotropne strukture nalaze kaotično u preparatu (na primjer, kristali), onda kada ih proučavate, morate stalno rotirati pozornicu kako biste postigli sjaj jedne ili druge grupe objekata.

Za dublju analizu i evaluaciju topooptičkih reakcija potrebno je poznavati metodologiju za određivanje relativnog predznaka dvoloma, veličine razlike putanje zraka i indeksa (koeficijenta) refrakcija.

Znak dvolomnosti karakteriše stepen i pravac pomeranja putanje svetlosnih zraka koje prolaze kroz analizator. Ovaj pomak uzrokovan je topooptičkim bojama, a ako je usmjeren na smanjenje razlike u putanji zraka, one govore o negativnom predznaku dvolomnosti ( negativna anizotropija), ako pomaže da se poveća razlika u putanji zraka, tada se navodi pozitivan znak dvoloma ( pozitivna anizotropija). Ako razlika u putanji zraka nestane, onda se efekat anizotropije izravnava.

Znak dvoloma se određuje pomoću kompenzatora. Procedura za njegovu upotrebu je sljedeća. Objekat koji se proučava postavlja se u poziciju u kojoj se postiže maksimalna luminiscencija anizotropnih struktura u tamnom vidnom polju. RI kompenzatorska ploča se rotira oko optičke ose pod uglom od +45° u odnosu na ravan polarizacije analizatora. Objekt, ovisno o razlici u putanji svjetlosnih zraka, koja može biti u rasponu od 20 do 200 nm, poprima ili plavu ili žutu boju. U prvom slučaju, znak dvolomnosti je pozitivan, u drugom - negativan. Treba imati na umu da u slučaju kada se kompenzator nalazi pod kutom od +45°, ukupna pozadina zatamnjenog vidnog polja ima crvenu nijansu.

Može se koristiti i λ/4 kompenzator (U-TP137). Postupak korištenja je isti, samo vidno polje ima sivu nijansu, a ne crvenu, a objekt svijetli pozitivnim predznakom prelamanja, a zatamnjen je negativnim predznakom.

Kvantitativno određivanje razlike u putanji svjetlosnih zraka, izraženo u nanometrima, vrši se pomoću Braque Köhler kompenzatora. Da biste to učinili, koristite formulu:

Γ=Γλ×sinφ

gdje je λ konstanta koju je proizvođač označio na kompenzatoru, φ je ugao rotacije kompenzatora u odnosu na ravan polarizacije analizatora.

Indeks prelamanja anizotropnog objekta određuje se poređenjem (pod mikroskopom) sa testnim objektom koji se nalazi pored njega. Kao ispitni objekti koriste se standardne tekućine sa poznatim indeksom prelamanja. Predmet i uzorak se postavljaju jedan pored drugog na pozornicu. Kada im se indeksi loma ne podudaraju, između objekta i uzorka vidljiva je svjetlosna linija koja se zove Beckova linija. Podizanje cijevi mikroskopa u odnosu na fokusnu poziciju uzrokuje pomak Beckove linije prema mediju, što daje izraženiji efekat refrakcije. Kada se indeksi loma objekta i uzorka poklope, Bekova linija nestaje. Tipično, indeks loma se određuje u monokromatskom svjetlu za natrijevu liniju spektra (na valnoj dužini od 589 nm i temperaturi od 20 °C). Refrakciju treba odrediti za dvije međusobno okomite ravni polarizacije. U tu svrhu se uklanja analizator i snima se prelamanje objekta u njegova dva međusobno okomita položaja. Razlika između oba indeksa prelamanja (ng - nk) karakteriše jačinu prelamanja.

OSOBINE OBRADE MATERIJALA I PRIPREME PREPARATA

Fiksni materijal za polarizacionu mikroskopiju u kiselom formalinu je nepoželjan, jer formalinski pigment nastao interakcijom tkivnog hemoglobina sa kiselim formaldehidom ima anizotropna svojstva i otežava proučavanje preparata u polarizovanom svetlu. G. Scheuner i J. Hutschenreiter (1972) preporučuju upotrebu 10% neutralnog formalina, Bakerovog rastvora kalcijum-formola i Carnoyeve tečnosti za ovu svrhu.

Trajanje fiksacije u 10% neutralnom formalinu je 24 - 72 sata na 4 °C, u Bakerovoj otopini kalcijum-formola - 16 - 24 sata na 4 °C. Fiksacija u kalcijum-formolu je posebno poželjna kada se proučavaju jedinjenja lipida i proteina. Carnoyeva tečnost brzo zasićuje tkanine. Komadi debljine 1 - 2 mm mogu se profilisati nakon samo 1 sat na temperaturi od 4 °C. Fiksacija u Carnoyevoj tečnosti nije pogodna za studije lipida. Osim toga, koristi se Zenkerova tekućina, posebno kada je impregnirana solima zlata i srebra. Nakon tretmana mješavinom Zenkerove tekućine i octene kiseline, crvena krvna zrnca stiču sposobnost da se podvrgnu dvolomu.

Prilikom ispitivanja gustih tkiva (kosti, zuba) u polarizirajućem mikroskopu, osim kiselog dekalcifikacije, potrebna je i dodatna obrada za uklanjanje kolagenih vlakana. U tu svrhu, delovi takvih tkiva se kuvaju nekoliko minuta u mešavini glicerina i kalijum hidroksida (10 ml glicerina i 2 zrna kalijum hidroksida) dok potpuno ne pobele, zatim se lužina pažljivo ocedi, presek se ispere u vodi. i prebačen pincetom u fazu mikroskopa.

Za polarizacionu mikroskopiju koriste se parafinski, smrznuti i kriostatski preseci. Neobojeni zamrznuti delovi za pregled pod polarizovanim svetlom su ugrađeni u glicerol. Nefiksirane kriostatske sekcije su pogodne za polarizacionu mikroskopsku analizu odmah nakon pripreme. Zbog njihove visoke osjetljivosti na štetno djelovanje različitih faktora okoline, i dalje se preporučuje fiksiranje ovih presjeka u 10% neutralnom rastvoru formaldehida ili kalcijum-formola.

Na rezultate polarizacione mikroskopije utiče debljina histoloških preseka. Prilikom proučavanja debelih presjeka stvaraju se uvjeti za superpoziciju različitih anizotropnih struktura jedna na drugu. Osim toga, s različitim debljinama rezova, anizotropna svojstva struktura koje se proučavaju mogu se promijeniti, pa je vrlo važno, posebno u komparativnim studijama, osigurati konstantnu debljinu kriške. Preporučena maksimalna debljina presjeka ne smije prelaziti 10 µm.

Drugi obavezan uslov je pažljivo deparafinisanje preseka, jer neuklonjeni ostaci parafina daju izražen efekat anizotropije, što otežava studiju. Parafin se posebno dugo zadržava na crvenim krvnim zrncima i jezgrima ćelija. Kako bi se u potpunosti uklonio parafin iz sekcija, preporučuje se da se izvrši sljedeća obrada.

Ksilen 30 min
Alkohol 100% 5 min
Mešavina metanola i hloroforma (1:1) na 50 °C tokom 24 sata
Alkohol 100% 5 min
Alkohol 70% 10 min Voda

Takođe treba imati na umu da preseci koji su podvrgnuti polarizacionoj mikroskopiji ne bi trebalo da dolaze u kontakt sa fenolima (na primer, ne bi trebalo da se čiste u karbonskom ksilenu).

Detaljnije informacije o polarizacionoj mikroskopiji i upotrebi kompenzatora mogu se dobiti na linku (http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/polarized/polarizedhome.html).

Ako imate bilo kakvih pitanja o polarizacionoj mikroskopiji, obratite se Školi za mikroskopiju.