Kratka istorija razvoja tečne hromatografije. Povijest otkrića hromatografije Kromatografija čvrste stacionarne faze

Otkrivač hromatografije bio je ruski naučnik, botaničar i fizički hemičar Mihail Semjonovič Cvet.

Otkriće hromatografije datira iz vremena kada je Tsvet završio magistarski rad u Sankt Peterburgu (1900 - 1902) i prvog perioda rada u Varšavi (1902 - 1903). Proučavajući biljne pigmente, Tsvet je kroz epruvetu napunjenu adsorbentom - kalcijum karbonatom u prahu propuštao otopinu mješavine pigmenata vrlo malo različitih boja, a zatim ispirao adsorbent čistim rastvaračem. Pojedinačne komponente mješavine su se odvojile i formirale obojene pruge. Prema modernoj terminologiji, Tsvet je otkrio razvojnu verziju hromatografije (razvoj tečne adsorpcione hromatografije). Glavne rezultate istraživanja o razvoju verzije hromatografije koju je stvorio Cvet je izneo u knjizi „Kromofili u biljnom i životinjskom svetu“ (1910), koja je njegova doktorska disertacija. hromatografija gasni sediment jonska izmjena

Tsvet je naširoko koristio kromatografsku metodu ne samo za odvajanje smjese i utvrđivanje njene višekomponentne prirode, već i za kvantitativnu analizu; u tu svrhu je razbio staklenu kolonu i isjekao adsorbentnu kolonu na slojeve. Tsvet je razvio opremu za tečnu hromatografiju, prvi je sproveo hromatografske procese na sniženom pritisku (pumpavanje) i na izvesnom viškom pritiska i razvio preporuke za pripremu efektivnih kolona. Osim toga, uveo je mnoge osnovne pojmove i pojmove nove metode, kao što su "hromatografija", "razvoj", "pomak", "hromatogram" itd.

Kromatografija je prvi put korištena vrlo rijetko, njen latentni period je trajao oko 20 godina, tokom kojih se pojavio samo vrlo mali broj izvještaja o različitim primjenama metode. I tek 1931. godine, R. Kuhn (Nemačka), A. Winterstein (Nemačka) i E. Lederer (Francuska), radeći u hemijskoj laboratoriji (koja je vodio R. Kuhn) Instituta za medicinska istraživanja cara Wilhelma u Hajdelbergu, upravljali su izolovati a- i b-karoten iz sirovog karotena i na taj način demonstrirati vrijednost otkrivanja boje.

Važna faza u razvoju hromatografije bilo je otkriće sovjetskih naučnika N.A. Izmailov i M.S. Schreiber metode tankoslojne hromatografije (1938), koja omogućava analizu mikrokoličinama supstance.

Sljedeći važan korak bilo je otkriće A. Martina i R. Syngea (Engleska) varijante tečne particione hromatografije na primjeru razdvajanja acetilnih derivata aminokiselina na koloni ispunjenoj silika gelom zasićenom vodom, korištenjem kloroforma kao rastvarač (1940). Istovremeno je uočeno da se kao mobilna faza može koristiti ne samo tečnost, već i gas. Nekoliko godina kasnije, ovi naučnici su predložili da se izvrši odvajanje derivata aminokiselina na papiru navlaženom vodom sa butanolom kao mobilnom fazom. Takođe su implementirali prvi dvodimenzionalni sistem razdvajanja. Martin i Singh dobili su Nobelovu nagradu za hemiju za svoje otkriće particione hromatografije. (1952). Zatim su Martin i A. James izveli verziju plinske distribucijske hromatografije, razdvajajući smjese na miješanom sorbentu silikona DS-550 i stearinske kiseline (1952. - 1953.). Od tada je metoda plinske hromatografije dobila najintenzivniji razvoj.

Jedna od varijanti plinske hromatografije je krotermografija, u kojoj se, radi poboljšanja odvajanja mješavine plinova, istovremeno s kretanjem pokretne faze – plina, na sorbent i smjesu koja se odvaja, djeluje pokretno temperaturno polje koje ima određeni gradijent duž dužine (A.A. Zhukhovitsky et al., 1951.) .

Značajan doprinos razvoju hromatografske metode dao je G. Schwab (Nemačka), osnivač hromatografije izmene jona (1937 - 1940). Dalje je razvijen u radovima sovjetskih naučnika E.N. Gapon i T.B. Gapon, koji je izvršio hromatografsko razdvajanje mješavine jona u otopini (zajedno sa F.M. Shemyakin, 1947), a također je implementirao ideju koju je Tsvet izrazio o mogućnosti hromatografskog odvajanja mješavine supstanci na osnovu razlike u rastvorljivosti teško rastvorljivi sedimenti (sedimentna hromatografija, 1948).

Moderna faza u razvoju jonoizmenjivačke hromatografije započela je 1975. godine nakon rada G. Smalla, T. Stevensa i W. Baumana (SAD), u kojem su predložili novu analitičku metodu nazvanu jonska hromatografija (varijanta visokoučinkovite hromatografije). jonoizmenjivačka hromatografija sa konduktometrijskom detekcijom).

Od izuzetne važnosti bilo je stvaranje kapilarne verzije hromatografije (1956) od strane radnika kompanije Perkin-Elmer, M. Golaya (SAD), u kojoj se sorbent nanosi na unutrašnje zidove kapilarne cevi, što čini moguće je analizirati mikrokoličine višekomponentnih mješavina.

Krajem 60-ih godina. Interes za tečnu hromatografiju naglo se povećao. Pojavila se tečna hromatografija visokih performansi (HPLC). To je olakšano stvaranjem visokoosjetljivih detektora, novih selektivnih polimernih sorbenata i nove opreme koja omogućava rad na visokim pritiscima. Trenutno, HPLC zauzima vodeću poziciju među ostalim metodama hromatografije i implementira se u različitim verzijama.

Kromatografske tehnike preovlađuju između ostalih u praćenju kvaliteta zraka u radnim područjima u industriji i industrijskoj higijeni; oni čine osnovu velike većine toksikoloških studija; Koristeći plinsku hromatografiju, liječnici su uspjeli proučiti „sindrom bolesne zgrade“ - loše zdravlje i neke bolesti uzrokovane prisustvom velikog broja štetnih hemikalija koje se oslobađaju iz sintetičkih materijala u zraku stambenih i poslovnih zgrada (tepisi, staze, itd.). paneli, linoleum, presvlake i dr.), mastike, lakovi, obloge i drugi proizvodi kućne hemije, kao i emisije gasova tokom rada laserskih štampača i gasnih grejača.[...]

Proces hromatografskog odvajanja zasniva se na sorpciji, sa kojom se susrećemo u svakodnevnom životu – apsorpciji supstanci čvrstom površinom (adsorpcija) ili rastvaranju gasova i tečnosti u tečnim rastvaračima (apsorpcija). Najpoznatija primena adsorpcije je pročišćavanje vazduha u gas maskama: adsorbens (aktivni ugljen) koji puni kutiju gas maske zadržava štetne nečistoće ili hemijske agense sadržane u vazduhu. Apsorpcija je karakteristična za mnoge biološke procese, posebno za proces disanja. Apsorpcija kiseonika hemoglobinom u krvi u plućima je takođe, u određenoj meri, hromatografski proces, jer uključuje sorpciono odvajanje kiseonika od drugih gasova prisutnih u udahnutom vazduhu. Nažalost, štetne nečistoće iz zraka također se apsorbiraju u krvi i to ponekad nepovratno.[...]

Osoba koja je prva ispravno objasnila proces sorpcije (pojave koje se javljaju kada se supstanca kreće duž sloja sorbenta) bio je ruski naučnik Mihail Semenovič Cvet. Koristeći ove fenomene, stvorio je izvanrednu analitičku metodu, pokazao njene široke mogućnosti i dao ime kojim do danas označavamo ne samo metodu, već i sam proces i naučnu disciplinu koja ga proučava.[...]

Ali budući da su različite tvari različito ekstrahirane benzenom iz adsorbenta (krede), one su se spuštale kroz cijev različitim brzinama. Stoga se izvorni zeleni prsten, koji se spuštao, postupno širio i dijelio na nekoliko prstenova u boji. Na kraju je bilo šest ovih prstenova: gornji je bio žuti, pa maslinastozeleni, pa tamnozeleni i tri žuta.[...]

Cvet je uklonio sloj krede sa cevi, isekao je na cilindre, od kojih je svaki imao svoj prsten u boji. Sada je bilo moguće ekstrahovati supstance iz adsorbenta alkoholom i ispitati ih. Kao rezultat toga, naučnik je pokazao da hlorofil nije pojedinačno jedinjenje, već mješavina dviju tvari koje su se odvojile na stupcu krede i dale maslinastozelene i tamnozelene prstenove. Preostale supstance su ksantofili.[...]

Boja se naziva višebojna slika koja se dobija pri odvajanju supstanci hromatogramom, a sama metoda (zasnovana na razdvajanju supstanci prema njihovoj sklonosti ka adsorpciji) hromatografska adsorpciona analiza, odnosno hromatografija.[...]

Prije 1914. Cvet je objavio nekoliko članaka o hromatografiji, ali nakon njegovog rada metoda nije bila široko razvijena. Tek 1931. Kuhn, Winterstein i Lederer reproduciraju Tsvetove početne eksperimente (koristeći primjere odvajanja karotena iz mrkve, latica maslačka i žumanca kokošjeg jajeta). Ovako dugotrajni zaborav sada već klasičnog istraživanja uvelike je bio posljedica negativnih kritika tadašnjih vlasti, koje nisu mogle razumjeti svu dubinu otkrića mladog naučnika.[...]

Za razvoj metode particione hromatografije i njenih različitih varijanti, Martin i Singh su 1952. dobili Nobelovu nagradu. Od tog trenutka počinje savremena faza razvoja gasne hromatografije (1951-1952), kada A. A. Žuhovitski i njegove kolege (Rusija) predlažu hromatografiju, a A. Martin i A. Džejms - gasno-tečnu hromatografiju, uz pomoć od kojih su smjesu masnih kiselina uspjeli odvojiti na koloni sa dijatomitnim nosačem (Celite-545) impregniranim parafinskim uljem uz dodatak stearinske kiseline. Takav sorbent upija analizirane tvari mnogo slabije od, na primjer, aktivnog ugljika ili aluminijevog oksida, pa su James i Martin uspjeli odvojiti hlapljive organske kiseline u struji plina – dušika.[...]

Od tada je plinska hromatografija postala jedna od najčešćih metoda analize, pomoću koje se može proučavati izuzetno širok spektar supstanci – od plinova do visokomolekularnih tekućina i metala.[...]

Treba razjasniti neka terminološka pitanja u vezi sa klasifikacijom hromatografskih metoda. U svom najjednostavnijem slučaju, pojam "gasna hromatografija" odnosi se na metodu analize u kojoj se razdvajanje mješavine supstanci u kromatografskoj koloni vrši u struji plina (gas-nosač) koji se kontinuirano propušta kroz kolonu. Adsorpcija plina (odvajanje na adsorbentu - ugljik, silikagel ili aluminij oksid) i plin-tečnost (odvajanje na sorbentu - čvrsti nosač obložen tekućinom - stacionarna tečna faza) - sve su to varijante plinske kromatografije.

Na osnovu principa frakcioniranja:

Afinitetna hromatografija

Gel filtracija

Adsorpcija

Sedimentno

Adsorpcija-kompleksacija

Distribucija (normalna faza, reverzna faza).

Prema metodi evolucije:

Kromatografija isključivanja veličine

Kromatografska evolucija

Frontalna analiza

Ionska izmjenjivačka hromatografija.

Po lokaciji stacionarne faze:

Stubčasti hrom

Debeloslojna hromatografija

Tankoslojna hromatografija

Papirna (filmska) hromatografija.

Prema agregatnom sastavu faza:

Superkritična fluidna hromatografija

Tečna hromatografija (tečno-gel, tečno-tečno, tečno-čvrsta faza)

Plinska hromatografija (gas-čvrsta faza, gas-tečnost).

Po svrsi ponašanja:

Analitički

Preparative

Industrial.

Pritiskom u hromatografskom sistemu:

Visok pritisak

Nizak pritisak.

2. Istorija razvoja tečne hromatografije.

Kromatografiju je otkrio MS Tsvet 1903. godine u obliku kolonske tečno-adsorpcione metode.Ovom metodom su korišteni adsorbenti veličine zrna veće od 50-100 mikrona, eluent je prolazio kroz kolonu gravitacijom zbog gravitacije, nije bilo detektori protoka Odvajanje se odvijalo sporo, u roku od nekoliko sati, te se u ovom modu tečna hromatografija nije mogla koristiti u analitičke svrhe. U periodu 1965-1970, napori stručnjaka iz različitih zemalja bili su usmjereni na stvaranje brze tečne hromatografije. Bilo je jasno da je za povećanje brzine razdvajanja potrebno skratiti puteve vanjske i unutrašnje difuzije. Ovo se može postići smanjenjem prečnika zrna adsorbenta.Punjenje kolona sitnim zrncima (5-10 μm) stvaralo je visok ulazni pritisak, što je zahtevalo upotrebu pumpi visokog pritiska. Tako je nastala tečna hromatografija visokog pritiska. Prelaskom na finofrakcione adsorbente, efikasnost kolona se značajno povećala (po jedinici dužine, stotine puta veća od efikasnosti kolona u gasnoj hromatografiji), pa je moderna brza analitička tečna hromatografija nazvana tečna hromatografija visokih performansi (HPLC). Razvoj krutih finozrnatih adsorbenata (5 ili 10 μm), stvaranje pumpi visokog pritiska (preko 200 atm) i protočnih detektora - sve je to osiguralo visoke performanse HPLC-a. U pogledu vremena razdvajanja, nije bilo inferiorniji u odnosu na plinsku hromatografiju, a u područjima primjene ju je značajno nadmašio. Ovaj vremenski period počeo se nazivati drugim rođenjem tečne hromatografije, preporodom, periodom njene renesanse. Jedan od prvih komercijalnih tečnih hromatografa bio je Du Pont model 820 (1968.) Tome je prethodio razvoj serije detektora za tečnu hromatografiju: konduktometrijski detektor (1951), detektor toplote adsorpcije (1959), refraktometrijski detektor detektor (1962.) i UV detektor (1966.), tečni hromatograf/maseni spektrometar (1973.), prva verzija detektora sa diodnim nizom (1976.) Godine 1969., I Halasz i I Sebastian, predložili smo sorbente sa hemijski kalemljenim alkilom. lanci (“brush sorbenti”) sa Si - O - C vezama. Ova veza se pokazala nestabilnom. J. Kirkland je 1970. razvio sorbente sa stabilnijim Si-O-Si vezama. Radi pravednosti, treba napomenuti da je ovakvu modifikaciju mnogo ranije (1959.) predložio K.D. Ščerbakova i A.V. Kiselev.

U našoj zemlji tekući hromatografi su razvijeni 1969-1972, to su modeli Tsvet-1-69, Tsvet-304, XG-1301.

Savremena faza HPLC-a: Trenutno je HPLC vodeći

pozicije među ostalim metodama hromatografije kako po obimu proizvedene opreme (više od 40.000 hromatografa godišnje u vrednosti više od 2 milijarde dolara) tako i po broju publikacija (5-6 hiljada publikacija godišnje).

Uloga HPLC-a je takođe velika u vitalnim oblastima nauke i proizvodnje kao što su biologija, biotehnologija, prehrambena industrija, medicina, farmacija, forenzička ispitivanja, kontrola zagađenja životne sredine, itd. HPLC je igrao veliku ulogu u dešifrovanju ljudskog genoma, u poslednje vreme godine uspješno rješava probleme

kućice proteomike.

Kromatografija je metoda razdvajanja i određivanja supstanci zasnovana na raspodjeli komponenti između dvije faze - pokretne i stacionarne. Stacionarna faza je čvrsta porozna supstanca (često se naziva sorbent) ili tečni film nanesen na čvrstu tvar. Mobilna faza je tekućina ili plin koji teče kroz stacionarnu fazu, ponekad pod pritiskom. Komponente analizirane smeše (sorbati) zajedno sa mobilnom fazom kreću se duž stacionarne faze. Obično se stavlja u staklenu ili metalnu cijev koja se naziva stupac. U zavisnosti od jačine interakcije sa površinom sorbenta (zbog adsorpcije ili nekog drugog mehanizma), komponente će se kretati duž kolone različitim brzinama. Neke komponente će ostati u gornjem sloju sorbenta, druge će, u manjoj interakciji sa sorbentom, završiti u donjem dijelu kolone, a neke će u potpunosti napustiti kolonu zajedno s mobilnom fazom (takve komponente su nazivaju nezadržanim, a njihovo vrijeme zadržavanja određuje “mrtvo vrijeme” kolone).

Ovo omogućava brzo odvajanje složenih mješavina komponenti.

Historija otkrića:

Rođenje hromatografije

U večernjim satima ovog dana, na sastanku biološkog odjela Varšavskog društva prirodnjaka, asistent katedre za anatomiju i fiziologiju biljaka Mihail Semenovič Cvet iznio je izvještaj „O novoj kategoriji adsorpcijskih fenomena i njihovoj primjeni na biohemiju analiza.”

Nažalost, M.S. Tsvet, kao botaničar po obrazovanju, nije dovoljno cijenio hemijsko-analitički aspekt svog otkrića i malo je objavljivao svoje radove u hemijskim časopisima. Nakon toga, hemičari su cijenili stvarni razmjer predloženog M.S. Metoda hromatografije u boji postala je najčešća metoda analitičke hemije.

Treba istaći sljedeće prednosti hromatografskih metoda:

1. Odvajanje je dinamičke prirode, a radnje sorpcije-desorpcije odvojenih komponenti se ponavljaju mnogo puta. To je zbog znatno veće efikasnosti hromatografije

razdvajanje u odnosu na statičke metode sorpcije i

ekstrakcija.

2. Tokom separacije koriste se različite vrste interakcija između sorbata i stacionarne faze: od čisto fizičke do hemisorpcije.

Ovo omogućava selektivno odvajanje širokog spektra

3. Na supstance koje se odvajaju mogu se primeniti razna dodatna polja (gravitaciona, električna, magnetna itd.), koja promenom uslova separacije proširuju mogućnosti hromatografije.

4. Kromatografija je hibridna metoda koja kombinuje istovremeno odvajanje i određivanje nekoliko komponenti.

5. Kromatografija vam omogućava da riješite i analitičke probleme (odvajanje, identifikacija, određivanje) i preparativne (prečišćavanje, izolacija, koncentracija). Rješenje ovih problema može se kombinirati izvođenjem na mreži.

Brojne metode su klasifikovane prema stanju agregacije faza, mehanizmu razdvajanja i tehnici razdvajanja.

Kromatografske metode se također razlikuju po načinu na koji se izvode.

proces razdvajanja na frontalni, pomak i eluent.

Ionska hromatografija

Jonska hromatografija je tečna hromatografija visokih performansi za odvajanje kationa i anjona na jonskim izmenjivačima

mali kapacitet. Široka upotreba jonske hromatografije

zbog niza njegovih prednosti:

– sposobnost određivanja velikog broja neorganskih i

organske jone, a istovremeno određuju katjone i

– visoka osjetljivost detekcije (do 1 ng/ml bez

predkoncentracija;

– visoka selektivnost i ekspresivnost;

– mala zapremina analiziranog uzorka (ne više od 2 ml uzorka);

– širok raspon detektabilnih koncentracija (od 1 ng/ml do

– mogućnost korištenja različitih detektora i njihovih kombinacija, što omogućava selektivnost i kratko vrijeme određivanja;

– mogućnost potpune automatizacije određivanja;

– u mnogim slučajevima potpuni nedostatak preliminarne pripreme uzorka.

Međutim, kao i svaka analitička metoda, ionska kromatografija nije bez svojih nedostataka, koji uključuju:

– složenost sinteze jonskih izmjenjivača, što uvelike komplikuje

razvoj metode;

– niža efikasnost separacije u odnosu na HPLC;

– potreba za visokom otpornošću na koroziju

hromatografski sistem, posebno pri određivanju

katjoni.

2.1 Istorija razvoja:

Proučavanje procesa jonske izmjene počelo je već početkom 19. stoljeća. iz zapažanja uticaja tla na hemijski sastav rastvora soli u kontaktu sa njim. Krajem 40-ih G. Thompson je primijetio da tlo apsorbira amonijak iz primijenjenih organskih gnojiva, a odgovarajuće eksperimente je izveo njihov stručnjak iz Yorka D. Spence. Prve rezultate eksperimenata D. Spencea objavio je G. Thompson 1850. godine. U članku se napominje da „prvo otkriće vrlo važnih svojstava tla može gotovo propasti kao korisno za poljoprivredu“, a njegovi posljednji radovi objavljeni su 1852. i 1855. godine.

2.3 Principi odvajanja jona u sorpcijskim procesima

Kromatografija jonske izmjene odnosi se na hromatografiju tekućine i čvrste faze u kojoj je mobilna faza tekućina (eluent), a stacionarna faza čvrsta (jonski izmjenjivač). Metoda jonske hromatografije zasnovana je na dinamičkom procesu zamene jona povezanih sa stacionarnom fazom sa eluentnim jonima koji ulaze u kolonu. Do razdvajanja dolazi zbog različitih afiniteta jona u smjesi za jonski izmjenjivač, što dovodi do različitih brzina njihovog kretanja kroz kolonu.

Jonska hromatografija je varijanta kolonske hromatografije jonske izmjene.

Prema preporukama IUPAC-a (1993.), pojmovi jonska izmjena (IEC) i jonska hromatografija (IC) definirani su kako slijedi. "Hromatografija ionske izmjene temelji se na razlici u interakcijama ionske izmjene za pojedinačne analite. Ako su joni razdvojeni i mogu se detektirati pomoću konduktometrijskog detektora ili indirektne UV detekcije, onda se to naziva jonska hromatografija."

Moderna (2005.) formulacija: “Ionska hromatografija uključuje sve tečne hromatografije visokih performansi (HPLC) odvajanja jona u kolonama, u kombinaciji sa direktnom detekcijom u detektoru protoka i kvantitativnom obradom rezultujućih analitičkih signala.” Ova definicija karakteriše jonsku hromatografiju bez obzira na mehanizam razdvajanja i metod detekcije i na taj način je odvaja od klasične izmene jona.

U ionskoj hromatografiji koriste se sljedeći principi razdvajanja:

Jonska izmjena.

Formiranje jonskih parova.

Isključivanje jona.

Jonska izmjena

Jonska izmjena je reverzibilna heterogena reakcija ekvivalentne izmjene jona koji se nalaze u fazi jonskog izmjenjivača (protujoni) sa eluentnim jonima. Protu jone drže funkcionalne grupe jonskog izmjenjivača zbog elektrostatičkih sila. Tipično u kationskoj hromatografiji ove grupe su grupe sulfonske kiseline; u slučaju anionske hromatografije – kvaternarne amonijumske baze. Na sl. Na slici 1 prikazan je dijagram procesa izmjene kationa i anjona. Joni analita su označeni kao A, a ioni eluenta koji se s njima nadmeću za centre za razmjenu označeni su kao E.

Rice. 1. Jonska izmjena kationa (A+) i anjona (A-) za eluentne jone (E+ ili E-) uz učešće kationskog izmjenjivača koji sadrži funkcionalne sulfo grupe - SO3-, i anionskog izmjenjivača (kvaternarne amonijum bazne grupe -N +R3).

Formiranje jonskih parova

Za implementaciju ovog mehanizma razdvajanja koriste se reagensi jonski par, koji se dodaju u otopinu eluenta. Takvi reagensi su anionski ili kationski surfaktanti, kao što su alkilsulfonske kiseline ili tetraalkilamonijeve soli.

Zajedno sa suprotno nabijenim detektabilnim ionima, joni ovog reagensa ion-par formiraju nenabijeni jonski par, koji se može zadržati na stacionarnoj fazi zbog međumolekularnih interakcija. Razdvajanje se vrši zbog razlike u konstantama formiranja jonskih parova i stepenu njihove adsorpcije na matrici sorbenta. Na sl. Slika 2 prikazuje statički model jonske izmjene u ion-parnoj hromatografiji nakon adsorpcije reagensa na stacionarnoj fazi. Ovaj princip razdvajanja se odnosi i na anione i na katione.

Rice. 2. Model ionske izmjene u ion-parnoj hromatografiji.

Ionsko isključenje

Ionska isključena hromatografija (IEC). Uglavnom se koristi za odvajanje slabih kiselina ili baza. IEC je od najveće važnosti za određivanje karboksilnih i aminokiselina, fenola i ugljikohidrata.

Na sl. Slika 3 prikazuje princip razdvajanja korištenjem IEC-a koristeći kiseline R–COOH kao primjer.

Rice. 3. Šema odvajanja karboksilnih kiselina R–COOH korištenjem ionske ekskluzijske hromatografije.

U ionskoj ekskluzijskoj hromatografiji, potpuno sulfonirani kationski izmjenjivač koji sadrži vodikove ione (protivione) često se koristi kao stacionarna faza. U vodenom rastvoru eluenta, grupe sulfonske kiseline ionskog izmenjivača su hidratizovane. Hidracijska ljuska je ograničena imaginarnom negativno nabijenom membranom (Donanova membrana). Membrana je propusna samo za nedisocirane molekule (na primjer, vodu).

Organske karboksilne kiseline mogu se odvojiti ako se kao eluens koriste jake mineralne kiseline. Zbog niskih vrijednosti konstanti kiselosti, karboksilne kiseline su prisutne u takvim otopinama u nedisociranom obliku. Ovi oblici mogu proći kroz Donnanovu membranu i biti adsorbirani na stacionarnu fazu.

Pošaljite svoj dobar rad u bazu znanja je jednostavno. Koristite obrazac ispod

Studenti, postdiplomci, mladi naučnici koji koriste bazu znanja u svom studiranju i radu biće vam veoma zahvalni.

Objavljeno na http://www.allbest.ru

1. Istorija otkrića i razvoja hromatografije

2. Osnovne odredbe

3. Klasifikacija hromatografskih metoda analize

4. Adsorpciona hromatografija. Tankoslojna hromatografija

4.1 Eksperimentalna tehnika u tankoslojnoj hromatografiji

5. Plinska hromatografija

5.1 Gasna adsorpciona hromatografija

5.2 Gasno-tečna hromatografija

6. Particiona hromatografija. Papirna hromatografija

7. Sedimentna hromatografija

7.1 Klasifikacija metoda sedimentne hromatografije prema eksperimentalnoj tehnici

7.2 Kromatografija sedimentnog papira

8. Jonsko-izmjenjivačka hromatografija

Zaključak

Bibliografija

1. PRIČAOTKRIĆE I RAZVOJ HROMATOGRAFIJE

Otkrivač hromatografije bio je ruski naučnik, botaničar i fizički hemičar Mihail Semjonovič Cvet.

Važna faza u razvoju hromatografije bilo je otkriće sovjetskih naučnika N.A. Izmailov i M.S. Schreiber metode tankoslojne hromatografije (1938), koja omogućava analizu mikrokoličinama supstance.

2. OSNOVNE TOČKE

1. Odvajanje je dinamičke prirode, a radnje sorpcije-desorpcije odvojenih komponenti se ponavljaju mnogo puta. To je zbog znatno veće efikasnosti hromatografskog odvajanja u odnosu na statičke metode sorpcije i ekstrakcije.

2. Tokom separacije koriste se različite vrste interakcija između sorbata i stacionarne faze: od čisto fizičke do hemisorpcije. Ovo omogućava selektivno odvajanje širokog spektra supstanci.

3. Na supstance koje se odvajaju mogu se primeniti razna dodatna polja (gravitaciona, električna, magnetna itd.), koja promenom uslova separacije proširuju mogućnosti hromatografije.

4. Kromatografija je hibridna metoda koja kombinuje istovremeno odvajanje i određivanje nekoliko komponenti.

6. Brojne metode su klasifikovane prema stanju agregacije faza, mehanizmu razdvajanja i tehnici razdvajanja. Kromatografske metode se razlikuju i po načinu izvođenja procesa razdvajanja na frontalni, pomak i eluent.

3. KLASIFIKACIJA METODA HROMATOGRAFSKE ANALIZE

Klasifikacije hromatografskih metoda zasnivaju se na principima koji uzimaju u obzir sljedeće različite karakteristike procesa razdvajanja:

* razlike u stanju agregacije faza korišćenog hromatografskog sistema;

* razlike u prirodi interakcija izdvojenih supstanci sa stacionarnom fazom;

* eksperimentalne razlike u metodama izvođenja procesa hromatografskog odvajanja.

Tabele 1-3 prikazuju glavne opcije klasifikacije za poznate hromatografske metode.

Budući da priroda interakcija jedinjenja koja se odvajaju sa fazama različitih hromatografskih sistema može uveliko varirati, gotovo da nema objekata za čije razdvajanje ne bi bilo moguće pronaći odgovarajuću stacionarnu fazu (čvrstu ili tečnu) i pokretnu fazu. sistemi rastvarača. Područja primjene glavnih varijanti hromatografije, u zavisnosti od molekulske mase ispitivanih jedinjenja, data su u tabeli. 4.

4. ADSORPCIJSKA HROMATOGRAFIJA. TANKOSLOJNA HROMATOGRAFIJA

Jedna od najčešćih metoda adsorpcione hromatografije je tankoslojna hromatografija (TLC), vrsta ravni hromatografije u kojoj se adsorbent koristi kao tanki sloj na ploči.

Princip i osnovni koncepti TLC metode. Tanak sloj sorbenta nanosi se na ovaj ili onaj način na čistu ravnu površinu (ploča od stakla, metala, plastike), koja se najčešće pričvršćuje na površinu ploče. Dimenzije ploče mogu biti različite (dužina i širina - od 5 do 50 cm, iako to nije potrebno). Na površini ploče, pažljivo, kako ne biste oštetili sloj sorbenta, označite (na primjer, olovkom) početnu liniju (na udaljenosti od 2-3 cm od donjeg ruba ploče) i završetak linija rastvarača.

Šema za razdvajanje komponenti A i B pomoću TLC

Uzorak se nanosi na početnu liniju ploče (mikrošpricom, kapilarom) - mala količina tekućine koja sadrži mješavinu supstanci koje treba odvojiti, na primjer, dvije supstance A i B u odgovarajućem rastvaraču. Otapalo se pusti da ispari, nakon čega se ploča uranja u hromatografsku komoru u tečnu fazu PF-a, koja je rastvarač ili mešavina rastvarača posebno odabranih za ovaj slučaj. Pod dejstvom kapilarnih sila, PF se spontano kreće duž NP od početne linije do linije fronta rastvarača, noseći sa sobom komponente A i B uzorka, koje se kreću različitim brzinama. U slučaju koji razmatramo, afinitet komponente A za NP je manji od afiniteta za istu fazu komponente B, stoga se komponenta A kreće brže od komponente B. Nakon što mobilna faza (otapalo) dođe do linije fronta rastvarača u vremenu t , hromatografija se prekida, ploča se izvadi iz hromatografske komore, i osuši na vazduhu i odredi položaj tačaka supstanci A i B na površini ploče. Mrlje (zone) obično imaju ovalni ili okrugli oblik. U slučaju koji se razmatra, tačka komponente A se pomerila sa startne linije na daljinu l A , komponenta B tačka - na daljinu l IN, a rastvarač je prošao kroz udaljenost L.

Ponekad se istovremeno sa nanošenjem uzorka supstanci koje se izdvajaju na startnu liniju nanose male količine standardne supstance, kao i supstanci svedoka (one koje se navodno nalaze u analiziranom uzorku).

Za karakterizaciju odvojenih komponenti u sistemu, uvodi se koeficijent mobilnosti Rf (ili Rf faktor):

R f=V 1 /V E= (l 1 /t)/ (L/t) =l 1 /L ,

Gdje V 1 = l 1 / t I V E= L/ t - prema brzini kretanja i- komponenta i rastvarač E; l 1 IL - pređenom putu i- m komponenta i rastvarač, respektivno, t je vrijeme potrebno da se rastvarač pomakne od početne linije do prednje linije rastvarača. Udaljenosti l 1 brojite od početne linije do centra tačke odgovarajuće komponente.

Tipično, koeficijent mobilnosti je unutar raspona R f =0 - 1. Optimalna vrijednost je 0,3-0,7.Hromatografski uslovi su odabrani tako da se vrijednost Rf razlikuje od nule i jedan.

Koeficijent mobilnosti je važna karakteristika sistema sorbent-sorbat. Za ponovljive i striktno konstantne hromatografske uslove R f = konst.

Koeficijent mobilnosti Rf zavisi od niza faktora: prirode i kvaliteta rastvarača, njegove čistoće; priroda i kvaliteta sorbenta (tanki sloj), ujednačenost njegovog zrnatosti, debljina sloja; aktivnost sorbenta (sadržaj vlage); eksperimentalne tehnike (mase uzoraka, dužina putovanja rastvarača L); vještina eksperimentatora itd. Dosljedna reprodukcija svih ovih parametara u praksi je ponekad teška. Da bi se izjednačio uticaj procesnih uslova, uvodi se koeficijent relativne pokretljivosti Rs.

Rs=l/l st=R f/R f( st ) ,

Gdje R f = l/ L; R f (st)= l st/ L; l cm - udaljenost od startne linije do centra standardne tačke.

Relativni koeficijent pokretljivosti Rs je objektivnija karakteristika pokretljivosti tvari od koeficijenta mobilnosti Rf.

Kao standard se često bira supstanca za koju, pod datim uslovima, Rf? 0.5. Na osnovu svoje hemijske prirode, standard je odabran da bude blizak supstancama koje se odvajaju. Koristeći standard, vrijednost Rs obično leži u rasponu Rs=0,1--10, optimalne granice su oko 0,5--2.

Za pouzdaniju identifikaciju odvojenih komponenti koriste se “svjedoci” - standardne tvari, čije se prisustvo pretpostavlja u analiziranom uzorku. Ako je R f = R f (širina), gdje su R f i R f (širina) koeficijenti mobilnosti date komponente i svjedoka, respektivno, onda je vjerojatnije pretpostaviti da je svjedok supstanca prisutna u hromatografiranoj mješavina.

Da bi se okarakterisalo razdvajanje dve komponente A i B pod ovim uslovima, uvodi se stepen (kriterijum) razdvajanja R(A/B):

R (A/B) = D l( =2D l ,

gdje je D l- rastojanje između centara tačaka komponenti A i B; a(A) i a(B) su prečnici tačaka A i B na hromatogramu, respektivno.

Što je veća vrijednost R (A/B), jasnije su razdvojene mrlje komponenti A i B na hromatogramu.

Za procjenu selektivnosti razdvajanja dvije supstance A i B koristi se koeficijent razdvajanja O:

a=l B / l A.

Ako a=1, tada komponente A i B nisu razdvojene.

Za određivanje stepena razdvajanja R (A/B) komponenti A i B.

4.1 Eksperimentalna tehnika u tankoslojnoj hromatografiji:

A) Uzorak prijave. Analizirani tečni uzorak se nanosi na startnu liniju kapilarom, mikrošpricom, mikropipetom, pažljivo dodirujući sloj sorbenta (prečnik tačke na startnoj liniji obično je od jednog do nekoliko milimetara). Ako se više uzoraka nanese na startnu liniju, onda razmak između tačaka uzoraka na startnoj liniji ne smije biti manji od 2 cm.Ako je moguće, koristite koncentrirane otopine. Mrlje se suše na vazduhu, nakon čega se vrši hromatografija.

b) Izrada hromatograma (hromatografija). Proces se provodi u zatvorenim hromatografskim komorama zasićenim parama rastvarača koji se koristi kao PF, na primjer, u staklenoj posudi prekrivenoj poklopcem.

Ovisno o smjeru kretanja PF-a, razlikuju se uzlazno, silazno I horizontalno hromatografija.

U verziji uzlazne hromatografije koriste se samo ploče sa pričvršćenim slojem sorbenta. PF se izlije na dno komore (kao potonja može se koristiti staklena čaša odgovarajuće veličine sa staklenim poklopcem), hromatografska ploča se postavlja okomito ili koso u komoru tako da se PF sloj na dnu posude komora vlaži donji dio ploče (ispod startne linije za ~1,5 - 2 cm). PF se zbog djelovanja kapilarnih sila odozdo prema gore (protiv gravitacije) kreće relativno sporo.

U varijanti silazne hromatografije koriste se i samo ploče sa fiksnim slojem. PF se dovodi odozgo i kreće se prema dolje duž sloja sorbenta ploče. Gravitacija ubrzava kretanje PF-a. Ova opcija se implementira kada se analiziraju mješavine koje sadrže komponente koje se sporo kreću s PF.

U verziji horizontalne hromatografije, ploča se postavlja horizontalno. Možete koristiti pravokutne ili okrugle ploče. Kada se koriste okrugle ploče (kružna verzija horizontalne hromatografije), početna linija se označava kao krug odgovarajućeg radijusa (~1,5-2 cm), na koji se nanose uzorci. U sredini okrugle ploče je izrezana rupa u koju je umetnut fitilj za napajanje PF. Potonji se kreće duž sloja sorbenta od središta kruga do njegove periferije. Kromatografija se izvodi u zatvorenoj komori - eksikatoru ili u Petrijevoj posudi. Uz kružnu opciju, do nekoliko desetina uzoraka može se analizirati istovremeno.

TLC metode koriste jednodimenzionalnu, dvodimenzionalnu, višestruku (ponovljenu), korak hromatografiju.

Kod pojedinačne hromatografije, analiza se izvodi bez promjene smjera kretanja PF-a. Ova metoda je najčešća.

Dvodimenzionalna hromatografija se obično koristi za analizu složenih smjesa (proteini, aminokiseline, itd.) Prvo se vrši preliminarno odvajanje smjese pomoću prvog PF 1. Kromatogram ne proizvodi mrlje od pojedinačnih supstanci, već od mješavina nekoliko nerazdvojenih komponenti. Zatim se kroz ove tačke povlači nova početna linija, ploča se okreće za 90° i ponovo hromatografiše, ali sa drugim PF 2, pokušavajući da konačno odvoji tačke mešavine na tačke pojedinačnih komponenti.

Ako je ploča kvadratna, tada se uzorak nanosi na dijagonalu ovog kvadrata blizu njegovog donjeg ugla. Ponekad se dvodimenzionalna hromatografija izvodi sa istim PF na kvadratnoj ploči.

Dijagram koji ilustruje princip dvodimenzionalne hromatografije:

a - hromatogram dobijen sa PF1;

b - hromatogram dobijen sa PF2

U višestrukoj (ponovljenoj) hromatografiji, postupak se izvodi nekoliko puta uzastopno sa istim PF (svaki put nakon sljedećeg sušenja) dok se ne dobije željeno razdvajanje mrlja komponenti smjese (obično ne više od tri puta).

U slučaju stepenaste hromatografije, proces se izvodi sa istom pločom uzastopno, koristeći svaki put novi PF, sve dok se ne postigne jasno razdvajanje mrlja.

V) Interpretacija hromatograma. Ako su mrlje na kromatogramu obojene, nakon sušenja ploča odredite udaljenost od početne linije do centra svake tačke i izračunajte koeficijente pokretljivosti. Ako analizirani uzorak sadrži bezbojne tvari koje daju neobojene tvari, tj. mrlje koje se vizualno ne mogu prepoznati na hromatogramu, potrebno je detekcija ove mrlje, zašto su hromatogrami manifest.

U nastavku su opisane najčešće metode detekcije.

Zračenje ultraljubičastim svjetlom. Koristi se za detekciju fluorescentnih spojeva (mrlje svijetle kada je ploča ozračena UV svjetlom) ili nefluorescentnih supstanci, ali pomoću sorbenta sa fluorescentnim indikatorom (sorbent svijetli, mrlje ne svijetle). Na taj način se, na primjer, otkrivaju alkaloidi, antibiotici, vitamini i druge ljekovite tvari.

Termičku obradu. Ploča, osušena nakon hromatografije, pažljivo se zagrijava (do ~200 °C), izbjegavajući potamnjenje samog sloja sorbenta (na primjer, kada tanki sloj sorbenta sadrži škrob). U ovom slučaju, mrlje se obično pojavljuju u obliku smeđih zona (zbog djelomične termolize organskih komponenti).

Hemijski tretman.Često se kromatogrami razvijaju tretiranjem reagensima koji formiraju obojena jedinjenja sa odvojenim komponentama smjese. U te svrhe koriste se različiti reagensi: pare joda, amonijaka, broma, sumpor-dioksida, sumporovodika, posebno pripremljene otopine kojima se ploče tretiraju. Koriste se i univerzalni i selektivni reagensi (koncept "univerzalnog" je prilično proizvoljan).

Univerzalni reagensi mogu poslužiti, na primjer, koncentrirana sumporna kiselina (pri zagrijavanju se uočava potamnjenje mrlja organskih spojeva), kiseli vodeni rastvor kalijum permanganata (zone se uočavaju u obliku smeđih mrlja na ljubičastoj pozadini sorbent), otopina fosfomolibdinske kiseline kada se zagrije (na žutoj pozadini pojavljuju se plave mrlje) itd.

Kao selektivni, na primjer, koristi se Dragendorffov reagens; Zimmermanov reagens; vodeni rastvor amonijaka bakar sulfata (10% CuSO 4, 2% amonijaka); mješavina ninhidrina C 9 H 4 O 3 H 2 O sa etanolom i sirćetnom kiselinom.

Dragendorffov reagens je rastvor baznog bizmut nitrata BiONO 3, kalijum jodida KJ i sirćetne kiseline u vodi. Koristi se za određivanje amina, alkaloida, steroida.

Cimermanov reagens se priprema tretiranjem 2% rastvora dinitrobenzena u etanolu sa rastvorom KOH alkalije, nakon čega sledi zagrevanje smeše na ~70-100 °C. Koristi se za otkrivanje steroida.

Ninhidrin se koristi za otkrivanje mrlja od amina, aminokiselina, proteina i drugih spojeva.

Koriste se i neke druge metode detekcije tačaka. Na primjer, mjeri se njihova radioaktivnost ako su neke od izdvojenih komponenti radioaktivne, ili se unose posebni dodaci radioaktivnih izotopa elemenata koji su uključeni u izdvojene komponente smjese.

Nakon detekcije mrlja na hromatogramu, one se identifikuju, tj. odrediti koji spoj odgovara određenom mjestu. U tu svrhu najčešće se koriste referentna mjesta “svjedoka”. Ponekad se tačke identifikuju po veličini koeficijenata mobilnosti Rf, upoređujući ih sa vrednostima Rf poznatim za date uslove. Međutim, takva identifikacija zasnovana na vrijednosti R f često je preliminarna.

Boja fluorescentnih mrlja se takođe koristi u svrhu identifikacije, jer različita jedinjenja fluoresciraju na različitim talasnim dužinama (različite boje).

U hemijskoj detekciji mrlja, selektivni reagensi proizvode obojene mrlje sa spojevima određene prirode, što se također koristi u svrhu identifikacije.

Koristeći TLC metodu, moguće je ne samo otkriti, već i kvantificirati sadržaj komponenti u smjesama. Da biste to učinili, ili analizirajte same mrlje na hromatogramu, ili izdvojite odvojene komponente iz kromatograma na ovaj ili onaj način (ekstrakcija, eluiranje odgovarajućim rastvaračima).

Prilikom analize tačaka, pretpostavlja se da postoji određena veza između površine tačke i sadržaja date supstance (na primer, prisustvo proporcionalne ili linearne veze), koja se utvrđuje konstruisanjem kalibracionog grafikona merenjem površina. spotova “svjedoka” - standardi sa poznatim sadržajem analizirane komponente.

Ponekad se upoređuje intenzitet boje mrlja, pod pretpostavkom da je intenzitet boje mrlje proporcionalan količini date obojene komponente. Za mjerenje intenziteta boje koriste se različite tehnike.

Kada se izdvojene komponente ekstrahuju iz hromatograma, dobija se rastvor koji sadrži ovu komponentu. Potonje se zatim određuje jednom ili drugom analitičkom metodom.

Relativna greška u kvantitativnom određivanju supstance pomoću TLC je 5-10%.

TLC je farmakopejska metoda i široko se koristi za analizu i kontrolu kvaliteta raznih lijekova.

5. GASNA HROMATOGRAFIJA

U gasnoj hromatografiji (GC), inertni gas (azot, helijum, vodonik), koji se naziva gas nosač, koristi se kao mobilna faza. Uzorak se isporučuje u obliku pare; stacionarna faza je ili čvrsta supstanca - sorbent (gasna adsorpciona hromatografija) ili tečnost visokog ključanja nanesena u tankom sloju na čvrsti nosač (gasno-tečna hromatografija). Razmotrimo opciju gasno-tečne hromatografije (GLC). Kieselgur (dijatomit), vrsta hidratisanog silika gela, koristi se kao nosač; često se tretira reagensima koji pretvaraju Si-OH grupe u Si-O-Si(CH 3) 3 grupe, što povećava inertnost nosača u odnosu na rastvarače. To su, na primjer, nosači "hromosorb W" i "gazohrom Q". Osim toga, koriste se staklene mikroperle, teflon i drugi materijali.

5.1 Gaso- adsorpciona hromatografija

Posebnost metode gasne adsorpcione hromatografije (GAC) je u tome što se kao stacionarna faza koriste adsorbenti sa visokom specifičnom površinom (10-1000 m 2 g -1), a određuje se raspodela supstanci između stacionarne i pokretne faze. procesom adsorpcije. Adsorpcija molekula iz gasne faze, tj. koncentrisan na granici između čvrste i plinovite faze, nastaje zbog intermolekularnih interakcija (disperzija, orijentacija, indukcija) elektrostatičke prirode. Moguće je formiranje vodonične veze, a doprinos ove vrste interakcije zadržanim zapreminama značajno opada sa povećanjem temperature.

Za analitičku praksu važno je da pri konstantnoj temperaturi količina adsorbirane tvari na površini C s bude proporcionalna koncentraciji ove tvari u plinovitoj fazi C m:

C s = ks m (1)

one. tako da se distribucija odvija u skladu sa linearnom izotermom adsorpcije (Za -- konstantno). U ovom slučaju, svaka komponenta se kreće duž stupa konstantnom brzinom, neovisno o njezinoj koncentraciji. Razdvajanje tvari je zbog različitih brzina njihovog kretanja. Stoga je u GAS-u izuzetno važan izbor adsorbenta čija površina i priroda površine određuju selektivnost (odvajanje) na datoj temperaturi.

Kako temperatura raste, toplina adsorpcije se smanjuje DH/T, o čemu zavisi zadržavanje, i shodno tome t R . Ovo se koristi u praksi analize. Ako se odvoje spojevi koji se jako razlikuju po isparljivosti na konstantnoj temperaturi, tada tvari s niskim ključanjem brzo eluiraju, one s visokim ključanjem imaju duže vrijeme zadržavanja, njihovi vrhovi u kromatogramu će biti sve manji i širi, a analiza traje dosta vremena . Ako se tokom procesa hromatografije temperatura kolone povećava konstantnom brzinom (programiranje temperature), tada će se pikovi slične širine u hromatogramu nalaziti ravnomerno.

Aktivni ugljen, silika gel, porozno staklo i aluminijum oksid se uglavnom koriste kao adsorbenti za GAS. Heterogenost površine aktivnih adsorbenata odgovorna je za glavne nedostatke GAC metode i nemogućnost određivanja jako adsorbiranih polarnih molekula. Međutim, mješavine visoko polarnih tvari mogu se analizirati na geometrijski i kemijski homogenim makroporoznim adsorbentima. Poslednjih godina proizvode se adsorbenti sa manje ili više ujednačenom površinom, kao što su porozni polimeri, makroporozni silika gelovi (Silochrome, Porasil, Spherosil), porozna stakla i zeoliti.

Metoda plinske adsorpcione hromatografije najčešće se koristi za analizu mješavina plinova i ugljovodonika niskog ključanja koje ne sadrže aktivne funkcionalne grupe. Izoterme adsorpcije takvih molekula su bliske linearnim. Na primjer, glineni se uspješno koriste za odvajanje O 2, N 2, CO, CH 4, CO 2. Temperatura kolone je programirana da skrati vrijeme analize smanjenjem t R plinova visokog ključanja. Na molekularnim sitima - visoko poroznim prirodnim ili sintetičkim kristalnim materijalima, čije sve pore imaju približno istu veličinu (0,4-1,5 nm) - mogu se odvojiti izotopi vodika. Za odvajanje metalnih hidrida (Ge, As, Sn, Sb) koriste se sorbenti koji se nazivaju porapaks. GAS metoda na kolonama s poroznim polimernim sorbentima ili ugljičnim molekularnim sitom je najbrži i najpogodniji način za određivanje vode u neorganskim i organskim materijalima, na primjer, u otapalima.

5.2 Gazo- tečna hromatografija

U analitičkoj praksi češće se koristi metoda plinsko-tečne hromatografije (GLC). To je zbog ekstremne raznolikosti tekućih stacionarnih faza, što olakšava odabir selektivne faze za datu analizu, linearnosti izoterme distribucije u širem rasponu koncentracija, što vam omogućava rad s velikim uzorcima i lakoćom dobijanja ponovljivih performansi kolone.

Mehanizam distribucije komponenti između nosača i stacionarne tečne faze zasniva se na njihovom rastvaranju u tečnoj fazi. Selektivnost zavisi od dva faktora: pritiska pare analita i njegovog koeficijenta aktivnosti u tečnoj fazi. Prema Raoultovom zakonu, prilikom rastvaranja, tlak pare tvari iznad otopine je str i je direktno proporcionalan njegovom koeficijentu aktivnosti g molnog udjela N i u rastvoru i pritisku pare čiste supstance R° i na datoj temperaturi:

p i = N i R° I (2)

Pošto je koncentracija i-te komponente u ravnotežnoj parnoj fazi određena njenim parcijalnim pritiskom, možemo pretpostaviti da je

P i ~ c m , i N i ~ c s tada

i koeficijent selektivnosti:

Dakle, što je niža tačka ključanja supstance (što je veći P 0 i), to se ona slabije zadržava u hromatografskoj koloni.

Ako su tačke ključanja supstanci iste, tada se za njihovo razdvajanje koriste razlike u interakciji sa stacionarnom tekućom fazom: što je interakcija jača, to je niži koeficijent aktivnosti i veće zadržavanje.

Stacionarne tečne faze . Da bi se osigurala selektivnost kolone, važno je odabrati ispravnu stacionarnu tečnu fazu. Ova faza mora biti dobar rastvarač za komponente smeše (ako je rastvorljivost niska, komponente vrlo brzo napuštaju kolonu), neisparljiva (tako da ne ispari na radnoj temperaturi kolone), hemijski inertna , mora imati nisku viskoznost (inače se proces difuzije usporava) i kada se nanese na nosač formira jednoličan film čvrsto vezan za njega. Sposobnost razdvajanja stacionarne faze za komponente datog uzorka treba da bude maksimalna.

Postoje tri vrste tečnih faza: nepolarne (zasićeni ugljovodonici, itd.), umjereno polarne (esteri, nitrili itd.) i polarne (poliglikoli, hidroksilamini, itd.).

Poznavajući svojstva stacionarne tečne faze i prirodu supstanci koje se odvajaju, na primer, klasu, strukturu, moguće je brzo odabrati selektivnu tečnu fazu pogodnu za odvajanje date smeše. Treba uzeti u obzir da će vrijeme zadržavanja komponenti biti prihvatljivo za analizu ako su polariteti stacionarne faze i supstance analiziranog uzorka bliski. Za otopljene tvari sličnog polariteta, redoslijed eluiranja obično korelira s tačkama ključanja, a ako je temperaturna razlika dovoljno velika, moguće je potpuno odvajanje. Za odvajanje supstanci bliskog ključanja različitog polariteta koristi se stacionarna faza, koja selektivno zadržava jednu ili više komponenti zbog dipol-dipol interakcije. Sa povećanjem polariteta tekuće faze, vrijeme zadržavanja polarnih spojeva se povećava.

Da bi se tečna faza ravnomjerno nanijela na čvrsti nosač, pomiješa se sa vrlo isparljivim rastvaračem, kao što je eter. U ovu otopinu se dodaje čvrsti nosač. Smjesa se zagrijava, rastvarač isparava, a tečna faza ostaje na nosaču. Ovako deponovanom stacionarnom tečnom fazom suvi nosač se puni u kolonu, pokušavajući da izbegne stvaranje šupljina. Da bi se osiguralo ujednačeno pakovanje, struja gasa se propušta kroz kolonu i istovremeno se u koloni kuca da se zbije pakovanje. Kolona se zatim zagreva na temperaturu 50°C iznad one na kojoj je predviđena za upotrebu pre nego što se poveže na detektor. U tom slučaju može doći do gubitaka tekuće faze, ali kolona ulazi u stabilan način rada.

Nosači stacionarnih tečnih faza. Čvrsti nosači za raspršivanje stacionarne tekuće faze u obliku homogenog tankog filma moraju biti mehanički čvrsti sa umjerenom specifičnom površinom (20 m 2 /g), male i ujednačene veličine čestica, a također biti dovoljno inertni da omoguće adsorpciju na sučelje čvrstog plina faze bio minimalan. Najmanja adsorpcija je uočena na nosačima od silaniziranog hromosorba, staklenih granula i fluoropaka (fluorokarbonskog polimera). Osim toga, čvrsti nosači ne bi trebali reagirati na povećanu temperaturu i trebali bi se lako navlažiti tekućom fazom. U plinskoj hromatografiji kelata, kao čvrsti nosač se najčešće koriste silanizirani bijeli dijatomitni nosači - dijatomit silicijum ili kizelgur. Dijatomit je mikroamorfni silicijum dioksid koji sadrži vodu. Takvi nosači uključuju hromosorb W, gasohrom Q, hromaton N, itd. Osim toga, koriste se staklene perle i teflon.

Hemijski vezane faze. Često se koriste modifikovani nosači, kovalentno vezani za tečnu fazu. U ovom slučaju, stacionarna tečna faza se čvršće zadržava na površini čak i pri najvišim temperaturama kolone. Na primjer, nosač dijatomita se tretira hlorosilanom sa dugolančanim supstituentom koji ima određeni polaritet. Hemijski vezana stacionarna faza je efikasnija.

6. DISTRIBUCIJSKA HROMATOGRAFIJA. HROMATOGRAFIJA PAPIRA (HROMATOGRAFIJA NA PAPIRU)

Particiona hromatografija se zasniva na korišćenju razlika u rastvorljivosti supstance koja se distribuira u dve tečne faze koje se ne mešaju. Obje faze - PF i NF - su tečne faze. Kada se tekući PF kreće duž tekućeg NP, kromatografirane tvari se kontinuirano redistribuiraju između obje tekuće faze.

Particiona hromatografija uključuje papirni hromatgrafička (ili papirna hromatografija) u svojim uobičajenim varijantama. U ovoj metodi, umjesto ploča sa tankim slojem sorbenta koji se koristi za TLC, koristi se specijalni hromatografski papir po kojem se, impregnirajući ga, tečni PF kreće tokom hromatografije od startne do ciljne linije rastvarača.

Razlikovati normalna faza i reverzna faza papirna hromatografija.

U opciji normalna faza Tečnost za papirnu hromatografiju NF je voda koja se sorbuje u obliku tankog sloja na vlaknima i nalazi se u porama hidrofilna papir (do 25% težine). Ova vezana voda se po strukturi i fizičkom stanju veoma razlikuje od obične tečne vode. U njemu se otapaju komponente izdvojenih smjesa.

Ulogu PF koji se kreće duž papira igra druga tečna faza, na primjer, organska tekućina s dodatkom kiselina i vode. Prije hromatografije, tekući organski PF se zasiti vodom tako da PF ne otopi vodu sorbiranu na vlaknima papira za hidrofilnu hromatografiju.

Kromatografski papir proizvodi industrija. Mora ispunjavati niz zahtjeva: biti pripremljen od visokokvalitetnih vlaknastih sorti pamuka, ujednačen po gustini i debljini, u smjeru orijentacije vlakana, kemijski čist i inertan u odnosu na NF i odvojene komponente.

U verziji sa normalnom fazom, kao PF najčešće se koriste tečne mješavine sastavljene od različitih rastvarača. Klasičan primjer takvog PF-a je mješavina octene kiseline, n-butanola i vode u volumnom omjeru 1:4:5. Koriste se i rastvarači kao što su etil acetat, hloroform, benzen itd.

U opciji obrnuta faza U papirnoj hromatografiji, tečni NP je organski rastvarač, dok je uloga tečnog PF voda, vodeni ili alkoholni rastvori ili mešavine kiselina i alkohola. Proces se izvodi pomoću hidrofobna papir za hromatografiju. Dobija se tretiranjem (impregnacijom) papira naftalenom, silikonskim uljima, parafinom itd. Nepolarni i niskopolarni organski rastvarači se upijaju na vlakna hidrofobnog papira i prodiru u njegove pore, formirajući tanak sloj tekućeg NF. Voda se ne zadržava na takvom papiru i ne vlaži ga.

Tehnika papirne hromatografije je generalno ista kao i TLC metoda. Obično se lonac analiziranog rastvora koji sadrži mešavinu supstanci koje treba odvojiti nanosi na traku hromatografskog papira na početnoj liniji. Nakon što je rastvarač ispario, papir ispod početne linije se uranja u PF, postavljajući papir okomito (okači ga). Zatvorite komoru poklopcem i izvršite hromatografiju sve dok PF ne dostigne prednju liniju rastvarača označenu na papiru. Nakon toga proces se prekida, papir se suši na zraku, otkrivaju se mrlje i identificiraju komponente smjese.

Papirna hromatografija, kao i TLC metoda, koristi se i u kvalitativnoj i u kvantitativnoj analizi.

Za kvantificiranje sadržaja jedne ili druge komponente mješavine koriste se različite metode:

1) polaze od prisustva određenog odnosa (proporcionalnog, linearnog) između količine supstance u tački i površine tačke (često se prvo konstruiše kalibracioni grafikon);

2) izmeriti izrezano mesto sa supstancom i čistim papirom iste površine, a zatim odrediti masu supstance koja se utvrđuje razlikom;

3) uzeti u obzir odnos između intenziteta boje mrlje i sadržaja određene komponente u njoj, koja daje boju mrlji.

U nekim slučajevima, tvari sadržane u mrljama ekstrahiraju se nekim rastvaračem, a zatim se ekstrakt analizira.

Papirna hromatografija je farmakopejska metoda koja se koristi za odvajanje smjesa koje sadrže i neorganske i organske tvari. Metoda je pristupačna i jednostavna za izvođenje, ali je općenito inferiornija od modernije TLC metode koja koristi tanak sloj sorbenta.

7. SEDIMENTARNA HROMATOGRAFIJA

Metoda sedimentne hromatografije koristi se prvenstveno za odvajanje i identifikaciju neorganskih jona uključenih u smeše.

Suština metode. Sedimentna hromatografija se zasniva na upotrebi hemijskih reakcija taloženja odvojenih komponenti smeše sa taložnim reagensom uključenim u NF. Odvajanje se vrši zbog nejednake rastvorljivosti nastalih spojeva, koji se prenose mobilnom fazom različitim brzinama: manje rastvorljive supstance se prenose iz PF sporije od rastvorljivijih.

Primjena metode može se ilustrovati na primjeru razdvajanja halogenih jona: hloridnih jona Cl-, bromidnih jona Br- i jodidnih jona I- koji se istovremeno nalaze u analiziranom vodenom rastvoru. Da biste to učinili, koristite hromatografsku kolonu (koja je staklena cijev sa zapornom slavinom na dnu) napunjenu sorbentom. Potonji se sastoji od nosača - aluminijum oksida Al 2 O 3 ili silicijum SiO 2, impregniranog rastvorom srebrnog nitrata AgNO 3 (sadržaj srebrnog nitrata je oko 10% masenog udjela u masi nosača sorbenta).

Vodeni rastvor koji sadrži mešavinu odvojenih anjona propušta se kroz hromatografsku kolonu. Ovi anioni stupaju u interakciju sa kationima srebra Ag +, formirajući slabo rastvorljive taloge srebrnih halogenida:

Ag + + I - > AgIv (žuta)

Ag + + Br - > AgBrv (krema)

Ag + + Cl - > AgClv (bijeli)

Rastvorljivost srebrnih halogenida u vodi raste sljedećim redoslijedom:

Agl (K° = 8,3*10 -17)< АgВг (К° = 5,3*10 -13) < AgCl (K°= 1,78*10 -10),

gdje su vrijednosti proizvoda rastvorljivosti na sobnoj temperaturi date u zagradama. Stoga će se prvo formirati žuti talog srebrnog jodida, a kao najmanje rastvorljiv na hromatogramu će se uočiti žuta (gornja) zona. Zatim se formira zona kremastog taloga srebrnog bromida (srednja zona). Na kraju se formira bijeli talog srebrnog klorida - donja bijela zona, koja potamni na svjetlu zbog fotokemijskog razlaganja srebrnog klorida uz oslobađanje finog metalnog srebra.

Rezultat je primarni hromatogram sedimenta.

Za jasnije razdvajanje zona, nakon dobijanja primarnog hromatograma, čisti rastvarač se propušta kroz kolonu dok se ne dobije hromatogram sekundarnog sedimenta sa jasnim razdvajanjem taložnih zona.

U opisanom primjeru, taložnik je bio dio NF-a, a kroz kolonu je propuštena otopina koja sadrži mješavinu jona koji se odvajaju. Moguće je, naprotiv, taložni rastvor proći kroz kolonu u kojoj se nalaze ioni koji se hromatografišu. Međutim, u ovom slučaju se formiraju mješovite zone.

Shema razdvajanja Cl-, Br- i I- jona u hromatografskoj koloni primjenom sedimentne hromatografije.

7.1 Klasifikacija metoda sedimentne hromatografije prema eksperimentalnoj tehnici

Obično razlikujem columnar sedimentna hromatografija, izvedena u hromatografskim kolonama, i planar sedimentna hromatografija, izvedena na papiru ili u tankom sloju sorbenta.

Smjese inertnih nosača sa precipitantom koriste se kao sorbenti u sedimentnoj hromatografiji; sorbenti koji zadržavaju taloženje u obliku jona (smole za ionsku izmjenu) ili u obliku molekula (aktivni ugljen); papir natopljen rastvorom za taloženje.

Najčešće odabrani nosači su silika gel, skrob, aluminijum oksidi, kalcijum oksidi, barijum sulfat, jonoizmenjivačke smole itd. Nosač se koristi u fino dispergovanom stanju sa veličinom čestica od oko 0,02-0,10 mm.

Reagensi koji se koriste kao precipitanti su oni koji sa hromatografiranim ionima formiraju slabo topljive taloge, na primjer, natrijum jodid NaI, natrijum sulfid Na 2 S, srebrni sulfat Ag 2 SO 4, kalijum ferocijanid K 4, oksihinolin, piridin itd.

Tipično, kada se koristi metoda kolonske sedimentne hromatografije, nakon prolaska čistog otapala kroz kolonu, dobijaju se jasno odvojene zone, od kojih svaka sadrži samo jednu komponentu (u slučaju kada se rastvorljivosti taloga razlikuju najmanje tri puta) . Metodu karakteriše dobra ponovljivost rezultata.

U slučaju stvaranja bezbojnih zona precipitata, kromatogram se razvija ili propuštanjem otopine razvijača kroz kolonu, koja sa precipitatom proizvodi obojene produkte reakcije, ili trenutnim uvođenjem razvijača u PF ili NF.

7.2 Kromatografija sedimentnog papira

Razmotrimo suštinu ove metode na primjeru analize vodenog rastvora koji sadrži mješavinu bakarnih katjona Cu 2+ ? gvožđe Fe 3+ i aluminijum Al 3+.

Analizirani vodeni rastvor se kapilarom nanosi na sredinu lista papira impregniranog rastvorom taložnika - kalijum ferocijanida K4. Joni bakra Cu 2+ i željeza Fe 2+ stupaju u interakciju s ferocijanidnim ionima i formiraju slabo topljive taloge:

2Cu 2+ + 4- > Cu 2 (smeđa)

4Fe 3+ + 3 4- >Fe4 (plavi)

Pošto je bakar(II) ferocijanid manje rastvorljiv od gvožđe(III) ferocijanida, prvo se formira talog bakar(II) ferocijanida, formirajući centralnu smeđu zonu. Zatim se formira plavi talog gvožđe(III) ferocijanida, dajući plavu zonu. Aluminijski joni se kreću prema periferiji, dajući bezbojnu zonu jer ne stvaraju obojeni aluminij ferocijanid.

Šema za odvajanje Cu2+, Fe3+ i Al3+ sedimentnom hromatografijom.

Na taj način se dobija primarni hromatogram u kojem se zone padavina delimično preklapaju.

Zatim se dobije sekundarni hromatogram. Da bi se to postiglo, odgovarajuće otapalo (u ovom slučaju, vodeni rastvor amonijaka) se kapilarom nanosi na centar primarnog hromatograma. Otapalo se spontano kreće od centra papira do periferije, noseći sa sobom taloge, koji se kreću različitim brzinama: zona rastvorljivijeg taloga gvožđeg ferocijanida kreće se brže od zone manje rastvorljivog precipitata bakarnog ferocijanida. U ovoj fazi, zbog razlike u brzinama kretanja zona, one su jasnije razdvojene.

Da bi se otkrili ioni aluminija koji formiraju bezbojnu perifernu zonu, razvija se sekundarni kromatogram - raspršen (iz boce sa raspršivačem) otopinom alizarina - organskog reagensa koji stvara ružičaste produkte reakcije s ionima aluminija. Uzmi vanjski ružičasti prsten.

8. HROMATOGRAFIJA IONSKIH IZMJENA

U hromatografiji ionske izmjene, razdvajanje komponenti smjese postiže se reverzibilnom interakcijom jonizujućih supstanci sa jonskim grupama sorbenta. Očuvanje električne neutralnosti sorbenta osigurava prisustvo protujona sposobnih za ionsku izmjenu koji se nalaze u neposrednoj blizini površine. Jon unesenog uzorka, u interakciji sa fiksnim nabojem sorbenta, izmjenjuje se sa protujonom. Supstance s različitim afinitetima prema fiksnim nabojima se dijele na anjonske ili kationske izmjenjivače. Anionski izmjenjivači imaju pozitivno nabijene grupe na površini i apsorbiraju anione iz mobilne faze. Kationski izmjenjivači shodno tome sadrže grupe s negativnim nabojem koje stupaju u interakciju s kationima.

Kao mobilna faza koriste se vodeni rastvori soli kiselina, baza i rastvarača kao što je tečni amonijak, tj. sistemi rastvarača koji imaju visoku dielektričnu konstantu i veću sklonost jonizaciji jedinjenja. Obično rade sa puferskim rastvorima koji vam omogućavaju da podesite pH vrednost.

Tokom hromatografskog odvajanja, joni analita se takmiče sa ionima sadržanim u eluentu, težeći interakciji sa suprotno nabijenim grupama sorbenta. Iz toga slijedi da se hromatografija ionske izmjene može koristiti za odvajanje bilo kojeg jedinjenja koja se na neki način mogu ionizirati. Moguće je analizirati čak i neutralne molekule šećera u obliku njihovih kompleksa s boratnim ionima.

Ionska izmjenjivačka hromatografija je neophodna za odvajanje visoko polarnih supstanci, koje se ne mogu analizirati GLC bez konverzije u derivate. Ova jedinjenja uključuju aminokiseline, peptide i šećere.

Jonoizmenjivačka hromatografija ima široku primenu u medicini, biologiji, biohemiji, za praćenje životne sredine, u analizi sadržaja lekova i njihovih metabolita u krvi i urinu, pesticida u prehrambenim sirovinama, kao i za odvajanje anorganskih jedinjenja, uključujući radioizotope, lantanoide, aktinide, itd. Analiza biopolimera (proteina, nukleinskih kiselina, itd.), koja je obično trajala satima ili danima, pomoću jonoizmenjivačke hromatografije vrši se za 20-40 minuta uz bolje odvajanje. Upotreba jonoizmenjivačke hromatografije u biologiji omogućila je direktno posmatranje uzoraka u biološkim medijima, smanjujući mogućnost preraspoređivanja ili izomerizacije, što može dovesti do pogrešne interpretacije konačnog rezultata. Zanimljivo je koristiti ovu metodu za praćenje promjena koje se dešavaju u biološkim tekućinama. Upotreba poroznih slabih anionskih izmjenjivača na bazi silika gela omogućila je odvajanje peptida. Mehanizam ionske izmjene može se predstaviti u obliku sljedećih jednačina:

za anionsku izmjenu X - + R + Y - - Y - + R + X -

za kationsku izmjenu X + + R - Y + - Y + + R - X +

U prvom slučaju, ion uzorka X - takmiči se sa jonom mobilne faze Y - za R + ionske centre jonskog izmjenjivača, au drugom slučaju, kationi uzorka X + se takmiče sa ionima mobilne faze Y + za R - jonski centri.

Naravno, ioni uzorka koji slabo stupaju u interakciju sa jonskim izmjenjivačem će se slabo zadržati na koloni tokom ovog takmičenja i prvi će biti isprani iz nje, i obrnuto, jače zadržani ioni će biti posljednji koji će eluirati iz kolone. . Tipično, sekundarne interakcije nejonske prirode nastaju zbog adsorpcije ili vodikovih veza uzorka sa nejonskim dijelom matrice ili zbog ograničene rastvorljivosti uzorka u mobilnoj fazi.

Odvajanje specifičnih supstanci prvenstveno zavisi od izbora najpogodnijeg sorbenta i mobilne faze. Kao stacionarne faze u jonoizmenjivačkoj hromatografiji koriste se jonoizmjenjivačke smole i silika gelovi sa cijepljenim ionogenim grupama.

Polistirenske ionske izmjenjivačke smole za HPLC s veličinom zrna od 10 μm ili manje imaju selektivnost i stabilnost, ali njihovu mrežnu strukturu karakterizira razmak između čvorova mreže od 1,5 nm, što je znatno manje od veličine pora silika gela koji se koristi za adsorpciju hromatografija (10 nm), usporava prijenos mase i, stoga, značajno smanjuje efikasnost. Jonske izmjenjivačke smole koje se koriste u HPLC su uglavnom kopolimeri stirena i divinilbenzena. Obično se dodaje 8-12% potonjeg. Što je veći sadržaj divinilbenzena, veća je krutost i čvrstoća polimera, veći je kapacitet i, po pravilu, selektivnost i manje bubrenje.

Slični dokumenti

Opće karakteristike hromatografskog procesa. Fizičko-hemijske osnove tankoslojne hromatografije, klasifikacija metoda analize. Varijante hromatografije po faznim stanjima. Kontrola kvaliteta prehrambenih proizvoda metodom TLC, oprema.

kurs, dodan 27.12.2009

Fenomeni koji se javljaju tokom hromatografije. Dva pristupa objašnjenju su teorijska teorija ploča i kinetička teorija. Plinska, tečna, papirna hromatografija. Metoda jonske izmjene. Slučajevi primjene jonoizmenjivačke hromatografije. Gel hromatografija.

sažetak, dodan 24.01.2009

Pojam i struktura polimernih sorbenata, istorijat njihovog nastanka i razvoja, njihov značaj u procesu particione hromatografije. Vrste polimernih sorbenata, mogućnosti njihove primjene u hromatografiji s isključenjem veličine. Značajke upotrebe tvrdih gelova.

sažetak, dodan 01.07.2010

Pojava i razvoj hromatografije. Klasifikacija hromatografskih metoda. Kromatografija na čvrstoj stacionarnoj fazi: gas, tečnost (tečno-adsorpciona). Kromatografija tečne stacionarne faze: plinsko-tečna i gel hromatografija.

sažetak, dodan 05.01.2009

Suština hromatografske metode, istorijat njenog razvoja i vrste. Područja primjene hromatografije, uređaji ili instalacije za hromatografsko odvajanje i analizu mješavina supstanci. Dijagram plinskog hromatografa, njegovi glavni sistemi i princip rada.

sažetak, dodan 25.09.2010

Osnove metode inverzne plinske hromatografije. Plinska hromatografija je univerzalna metoda za kvalitativnu i kvantitativnu analizu složenih smjesa i metoda za dobivanje pojedinačnih komponenti u njihovom čistom obliku. Primjena inverzne plinske hromatografije.

kurs, dodan 01.09.2010

Suština i sadržaj ion-parne hromatografije, njena upotreba u tečnoj hromatografiji i ekstrakciji za ekstrakciju lekova i njihovih metabolita iz bioloških tečnosti u organsku fazu. Varijante ion-parne hromatografije, karakteristične karakteristike.

sažetak, dodan 01.07.2010

Plinska hromatografija je jedna od najperspektivnijih fizikalno-hemijskih istraživačkih metoda, koja se trenutno ubrzano razvija. Klasifikacija hromatografskih metoda. Različite karakteristike procesa. Suština hromatografskih metoda.

sažetak, dodan 25.01.2010

Suština tečne hromatografije visokih performansi (HPLC) kao metode za analizu i odvajanje kompleksnih nečistoća. Sorbenti, koordinacijski zasićeni kelati; obrasci uticaja strukture liganda na ponašanje kelata u uslovima hromatografije reverzne faze.

sažetak, dodan 10.11.2011

Koncept i glavne faze metode ekskluzione hromatografije, njene osnovne karakteristike i područja primjene, sorte i njihove karakteristične karakteristike. Karakteristike opreme koja se koristi u procesu ekskluzione hromatografije.